同病異證H22腫瘤小鼠內分泌-免疫網絡的物質基礎*

方肇勤，潘志強，盧文麗，吳中華，管冬元，梁 超，張園園，王艷明，丁善萍，顏 彥

肝癌是我國的重大疾病、難治病，療效提高緩慢［1］，因而探索和提高肝癌的療效是一項長期而艱巨的任務。中醫藥在我國肝癌防治中發揮著重要的作用，在改善患者生存質量，延長帶瘤生存期等方面具有一定的優勢。中醫藥防治肝癌的特點是辨證論治，即依據“同病異證”實施“同病異治”。因此，揭示同病異證的發生機制和物質基礎，對于探索和發展辨證論治的療效是十分必要的。在肝癌等腫瘤藥效學和療效作用機制的研究中，腫瘤小鼠是最常用的模式生物。我們的前期研究表明，H22等腫瘤小鼠會自發形成氣血陰陽虛證，證情會發生自然演變和兼夾，與人類近似［2、3］，是研究同病異證和證候發生物質基礎的理想實驗動物;進而的研究發現同病異證腫瘤小鼠普遍存在神經-內分泌-免疫網絡大量的基因表達差異和特征。最近，我們采用標準化、計量化小鼠診法和辨證方法［4、5］，在同步接種 H22肝癌細胞的荷瘤小鼠中篩選出若干組同病異證小鼠，采用ELISA方法檢測其血清中內分泌、免疫系統等多基因產物的含量，以進一步揭示其同病異證的物質基礎，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及造模

(1)動物:清潔級KM小鼠250只，雄性，體質量22g±2g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司(動物生產許可證號為 SCXK(滬)2008-0003);動物使用許可證號為SYXK(滬)2009-0069;(2)隨機取20只為正常對照;(3)230只小鼠腋下接種H22腹水癌細胞，細胞濃度為4×107/ml，每只小鼠右腋下接種0.2ml細胞懸液。出瘤后第6～7天淘汰死亡和未出瘤小鼠，余180只腫瘤小鼠。

1.2 同病異證腫瘤小鼠檢測和篩選

1.2.1 接種后第7天診法檢測 計量化檢測指標［12、13］包括:(1)體重;(2)腋溫;(3)曠場及計算35s內水平跨格數和垂直站立數;(4)抓力;(5)爪和尾顯微拍照及提取反映紅色程度的r值;(6)瘤長短徑。

1.2.2 計量化辨證及證候嚴重度計算 接種后第7天每只小鼠給予計量化辨證，證候及程度計算方法［1、2］如下:(1)估算瘤體積和瘤重(cm3)=abb/2(a代表腫瘤的長徑，b代表腫瘤的短徑，單位cm/g);(2)邪盛衰度 =瘤重/所有瘤重均數。辨證標準:大于1.5為邪毒甚，大于2為邪毒壅盛，小于0.75為邪較弱，小于0.5為邪弱;(3)氣盛衰度=抓力/正常均數 ×0.5+水平/正常均數 ×0.3+站立/正常均數 ×0.2。辨證標準:與正常組比較，大于1.25為氣盛，小于 0.75為氣虛，小于 0.5為氣虛甚，小于0.25為氣虧;(4)陽盛衰度 =腋溫/正常均數。辨證標準:與正常組比較，大于1.02為陽氣盛，小于0.98為陽虛，小于0.95為陽虛重，小于 0.9為陽損;(5)陰盛衰度=去瘤體重/正常體重均數。辨證標準:與正常組比較，大于1.2為形豐，小于0.9為陰偏虛，小于0.85為陰虛，小于0.7為陰虧，小于0.6為液脫;(6)血盛衰度 =爪 r/正常均數 ×0.7+尾r/正常均數×0.3。辨證標準:與正常組比較，大于 1.1為血充盈，小于 0.95為血虛，小于 0.9為血虛重，小于0.85為血虧。

1.2.3 同病異證腫瘤小鼠篩選 不同組別的同病異證小鼠篩選方法:(1)正常對照組(正常組)。取氣血陰陽盛衰度居中者14只，其余淘汰。腫瘤小鼠以邪盛衰度大小排序，淘汰陽虛瀕臨死亡者;(2)邪毒壅盛瀕危者(邪危組)。取邪盛衰度最為嚴重且兼有輕度陽氣虛者21只(實際處死14只，以免次日部分自然死亡);(3)邪毒壅盛(邪毒組)。取邪盛衰度次于上組兼證少者17只(實際處死14只，以免次日部分自然死亡);(4)邪毒居中兼氣虛小鼠14只(氣虛組);(5)邪毒居中小鼠14只(邪中組);(6)邪毒微弱小鼠14只(邪微組)，其余腫瘤小鼠淘汰。

1.3 取材

(1)接種后第8天，摘除眼球取血制備血清，－80℃保存。各組取14只小鼠(邪危組隨機淘汰3只存活小鼠);而氣虛組僅存10只，邪中組13只。常規分離血清，血清樣本少者2只樣本合并，以保證同一份血清夠檢測所有指標;(2)引頸處死實驗動物，分離腫瘤、睪丸、胸腺、脾臟等稱重。

1.4 試劑盒及檢測方法

采用的ELISA試劑盒及各自所提供的方法:(1)ACTH(1-39，mouse，rat)(美 國，Peninsula Laboratories);(2)Mouse TSH(美國 Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd.);(3)Mouse Aldosterone(美國，Assay Designs，Inc);(4)Mouse Tri-iodothyronine(美 國，CALBIOTECH Inc.);(5)Mouse thyroxine(美 國，CALBIOTECH Inc.);(6)Mouse Free Tri-iodothyronine Indes(武 漢 EIAab Science Co.，Ltd);(7)Mouse Free Thyroxine(武漢EIAab Science Co.，Ltd);(8)Testoterone(美 國，R＆D Systems，Inc.);(9)Mouse IL-2(美國，R＆D Systems，Inc.);(10)Mouse IL-10(美 國，R＆D Systems，Inc.);(11)Mouse IL-12 p70(美國，R＆D Systems，Inc.);(12)Mouse TNF-α (美 國，R＆D Systems);(13)Mouse IFN-γ(美國，R＆D Systems)

1.5 統計方法

(1)實驗結果取存活并取材小鼠診法和辨證指標統計，以便與各實驗室檢測指標比較:(2)采用單因素方差分析及SPSS15.0數據處理。

2 結果

2.1 各組小鼠存活情況

230只小鼠在接種后，第6天去除未出瘤或出瘤不佳如破潰等小鼠10只，剩余220只，當日有3只小鼠死亡。第7天，診法和辨證前出現44只小鼠死亡，提示該批次實驗荷瘤小鼠腫瘤發展快、預后差。

接種后第8天(處死小鼠當天)，邪危組21只中自然死亡4只，邪毒組17只中自然死亡3只，氣虛組14只中自然死亡4只，邪中組14只中自然死亡1只(死亡率見圖1)。提示:(1)邪盛衰度大小確與預后有關［2］;(2)本實驗氣虛組死亡率偏高，可能與氣虛嚴重有關。

2.2 各組小鼠邪盛衰度與實際瘤重

(1)邪盛衰度。邪危組、邪毒組、氣虛和邪中組、邪微組等邪盛衰度依次減小，除氣虛組與邪中組接近外，差異均有統計意義(P＜0.05)，表明采用計量化辨證分組是可行的(圖2);(2)次日腫瘤取材。邪危組、邪毒組、邪中組、邪微組等實際瘤重依次減輕，與邪盛衰度近似(圖3)，其中邪中組、邪微組與其他組比較差異有統計意義(P＜0.05)，表明體表測量及計算瘤體積方法正確。值得注意的是，氣虛組瘤重明顯大于邪中組，提示在小鼠四診檢測到處死間約20h內，氣虛組腫瘤增殖快，這也可能是該組死亡率高、預后差的原因。

2.3 各組小鼠氣血陰陽盛衰度

(1)腫瘤發生后，荷瘤小鼠會自發形成氣虛，并隨著病情發展和邪盛衰度嚴重而加劇［2］。本實驗結果近似，總體上邪盛衰度愈重氣虛程度也愈重(圖4);其中與正常組比較，邪危組、邪毒組、氣虛組差異有統計意義(P＜0.05)。氣虛組氣盛衰度最小，除邪危組外，與其他組比較差異有統計意義(P＜0.05)。依據氣盛衰度辨證標準［4、5］與正常組比較，小于0.5為氣虛甚，表明本實驗氣虛組的氣虛程度十分嚴重，這可能是其預后差的主要原因;(2)腫瘤發生后，荷瘤小鼠會自發形成陽虛，并隨著病情發展與邪盛衰度嚴重而加劇［2］。本實驗結果近似，總體上邪盛衰度愈嚴重陽虛程度也愈嚴重(圖5)。其中與正常組比較，邪危組陰盛衰度下降，差異有統計意義(P＜0.05);(3)當腫瘤發展至中晚期，荷瘤小鼠會自發形成陰虛。本實驗未見陰虛表現(圖6);(4)腫瘤發生后，荷瘤小鼠會自發形成血虛，并隨著病情發展和邪盛衰度嚴重而加劇［2］。本實驗結果近似，總體上邪盛衰度愈嚴重血虛程度也愈嚴重(圖7)。其中與正常組比較，邪危組、邪毒組血盛衰度下降，差異有統計意義(P＜0.05)。

圖1 各組入選小鼠隔夜死亡率

圖2 各組小鼠邪盛衰度

圖3 各組小鼠瘤重

圖4 各組小鼠氣盛衰度

2.4 同病異證小鼠內分泌-免疫網絡的特征

2.4.1 腎上腺軸 (1)在腫瘤發生的早期，應激使垂體ACTH合成與釋放增加。本實驗與正常組比較，各組均顯著升高(P＜0.05)，且總體上與邪盛衰度呈正相關，但各組總量接近，沒有顯著差異(圖8)。提示:對于邪毒壅盛及瀕危荷瘤小鼠，垂體呈現出失代償征兆;同時垂體儲備有限，應激反應可能接近其極限;(2)與ACTH對應，腫瘤發生腎上腺醛固酮分泌增加，總體上與邪盛衰度呈正相關(圖9)，邪中組與邪微組差異有統計意義(P＜0.05)。其中邪危組下調，提示該組小鼠腎上腺出現失代償。鑒于醛固酮組間差異大，提示在受到ACTH的刺激后，還存在其他因素進一步調整和促進腎上腺醛固酮的分泌。

圖5 各組小鼠陽盛衰度

圖6 各組小鼠陰盛衰度

圖7 各組小鼠血盛衰度

圖8 各組小鼠血清ACTH含量

2.4.2 甲狀腺軸 (1)從邪中組和邪微組血清TSH含量升高看(與邪危組、邪毒組、氣虛組比較，差異具有統計意義，P＜0.05)，在腫瘤發生的早期，垂體TSH處于積極的應激反應狀態(圖10)。但隨著腫瘤的增大，邪危組、邪毒組和氣虛組 TSH含量下降。提示可能系垂體的儲能有限，在盡力滿足ACTH表達的同時，限制了 THS的表達;(2)與TSH對應，小鼠甲狀腺T3、T4血清含量與腫瘤大小和增速負相關。在腫瘤早期，T3有升高趨勢，而隨著邪盛衰度程度增加，如邪危組顯著下降，與邪中組比較，差異有統計意義(P＜0.05);而 T4在腫瘤發生后迅速抑制，與正常組比較，各組均顯著下調(P＜0.05);其中邪中組、邪微組與其余腫瘤小鼠組比較，差異有統計意義(P＜0.05)。顯然，與腎上腺軸相反，甲狀腺軸以抑制為主(圖11、12);(3)小鼠FT3、FT4血清含量T3、T4趨勢一致，但可以維持在較高和正常水平，其中FT3顯著升高(圖13，正常組比較，除邪毒組外其他各組差異均有統計意義，P＜0.05)，邪中組、邪微組與其余腫瘤各組差異均有差異(P＜0.05);FT4總體上有升高趨勢(圖14)，其中邪微組與邪毒組、氣虛組比較差異有統計意義(P＜0.05)，提示一些不明的機制在促進 T3、T4的轉化和利用。

圖9 各組小鼠血清醛固酮含量

圖10 各組小鼠血清TSH含量

圖11 各組小鼠血清T3含量

圖12 各組小鼠血清T4含量

2.4.3 性腺軸 (1)在腫瘤發生的早期，荷瘤小鼠睪丸有重量減輕趨勢，氣虛組與各組比較下降顯著(P＜0.05，圖15)，提示氣虛與性腺的關系密切，這也可能與該組預后差有關;(2)各組小鼠血清睪酮含量與THS模式近似:腫瘤早期邪毒微弱者有上調趨勢，而邪毒壅盛和預后差者，顯著下調(圖16)。與腎上腺軸相反，性腺軸也以抑制為主。

圖13 各組小鼠血清FT3含量

圖14 各組小鼠血清FT4含量

圖15 各組小鼠睪丸重量

圖16 各組小鼠血清睪酮含量

2.4.4 免疫系統 (1)胸腺重量。在腫瘤發生的早期，荷瘤小鼠胸腺已見減輕，其中邪危組、邪毒組、氣虛組與正常組比較，差異具有統計意義(P＜0.05);腫瘤邪毒程度嚴重者抑制更顯著，其中危組、邪毒組、氣虛組與邪中組比較，差異具有統計意義(P＜0.05)，氣虛證尤甚(圖17);(2)脾臟重量。在腫瘤發生的早期，荷瘤小鼠脾臟一致增重，與正常組比較差異有統計意義(P＜0.05)，但各腫瘤組間差距不大(圖18);(3)IL-2。小鼠IL-2表達量低，且個體差異大。在腫瘤發生的早期，荷瘤小鼠血清IL-2水平呈下降趨勢(圖19)，與胸腺萎縮的趨勢一致;(4)IL-10。荷瘤小鼠血清IL-10一致升高趨勢，與腫瘤大小趨勢一致，僅邪危組例外(圖20);其中邪毒組與正常組比較，差異具有統計意義(P＜0.05);(5)IL-12。正常小鼠幾乎檢測不到，而荷瘤小鼠血清IL-12顯著升高，與腫瘤大小趨勢相反;氣虛證預后差者例外(圖21);(6)腫瘤壞死因子-α。小鼠TNF-α表達量低，正常小鼠檢測不到且個體差異大。腫瘤發生后，TNF-α表達量上升，且與腫瘤體積呈負相關，僅邪微組除外(圖22);(7)干擾素-γ。與TNF-α一致，腫瘤發生后 IFN-γ表達量上升，與正常組比較除邪微組外，差異均有統計意義(P＜0.05)，且與腫瘤體積呈負相關(圖23)。

圖17 各組小鼠胸腺重量

圖18 各組小鼠脾臟重量

圖19 各組小鼠血清IL-2含量

圖20 各組小鼠血清IL-10含量

圖21 各組小鼠血清IL-12含量

圖22 各組小鼠血清腫瘤壞死因子-α含量

圖23 各組小鼠血清干擾素-γ含量

3 討論

3.1 肝癌小鼠的同病異證及實驗設計考慮

接種同樣數量的H22腹水癌細胞，在小鼠出瘤的早期腫瘤體積差異很大，是典型的“同病異證”。此外，部分小鼠還會出現典型的氣虛，是同病異證的另一表現。鑒于邪盛衰度與預后有關［2］，觀察不同程度的邪盛衰度小鼠內分泌和免疫系統的改變是揭示其同病異證物質基礎的有效途徑。因此，我們依據邪盛衰度篩選并分成4個組別:邪危組、邪毒組、邪中組、邪微組。同時鑒于氣虛是該階段常見兼證，篩選出邪毒居中兼氣虛小鼠(可與邪毒居中對照)。這樣，與正常對照組一道共計6個組別，便于相互比較與對照。

3.2 以腫瘤大小作為辨證條件依據

中醫學辨證論治往往抓住反映證候本質的四診信息，而不在于四診信息采集的多寡［6］，因而有“但見一證便是”的說法。腫瘤體積的大小，綜合反映了痰熱瘀毒病邪的嚴重程度。在相同造模條件下(接種同樣數量的腫瘤細胞，以及接種后相同的時間)，腫瘤體積大者，痰熱瘀毒邪盛，腫瘤發生和增殖快，預后差;腫瘤體積小者，痰熱瘀毒邪微，腫瘤發生和增殖慢，預后好［2］。依據我們以往大量的研究，以及本實驗結果看，按腫瘤體積的大小篩選的同病異證小鼠，的確存在內分泌和免疫客觀的差異和特征性的表現，驗證了辨證的合理性及其同病異證的客觀性。邪毒證候的形成確有其復雜的內在物質基礎。

3.3 因實致虛和因虛致實的因果關系

與人類腫瘤的發生機制不同，H22荷瘤小鼠沒有長期的肝臟受損、纖維化和異常增殖等背景，之前的免疫系統也處于正常狀態，所有的改變均發生在外來腫瘤細胞的接種之后。因此，從發病學角度看，是因實致虛(甲狀腺軸、性腺軸機能減退以及氣血陰陽虛證的發生)。但是，為什么接種同樣數量的腫瘤細胞會發生如此多變的同病異證呢?其內分泌、免疫系統與證候嚴重程度的對應性改變，可能與腫瘤細胞及接種局部環境、內分泌和免疫儲備差異有關，這還需要更多的實驗去解釋。

3.4 檢測指標和試劑盒方面的考慮

定購小鼠皮質酮試劑盒進口試劑盒周期長且保質期短，依據我們前期研究發現，同病異證小鼠皮質酮與醛固酮濃度有類似的改變，因而本實驗僅采用了小鼠醛固酮試劑盒。此外，鑒于難以購買到同一公司小鼠FT3、FT4試劑盒，我們采用了另一公司的產品，這導致兩類試劑盒有關濃度描述的差異，希望組間差異的對比是客觀的。

總之，荷瘤小鼠存在同病異證及其內在復雜及特征性的內分泌和免疫系統的改變。本研究為荷瘤小鼠個體化辨證論治及其療效評價提供了客觀的依據，也為比較和優化辨證論治方案提供了模式生物的依據。

［1］ 湯釗猷.從肝癌看癌癥臨床研究［J］.腫瘤，2009，29(1):1-3.

［2］ 方肇勤，侯 俐，盧文麗，等.荷瘤小鼠證候的發生、演變、兼證及預后［J］.上海中醫藥雜志，2007，411(1):57-62.

［3］ 潘志強.方肇勤，盧文麗，等.不同品系H22肝癌小鼠證候特征的比較研究［J］.上海中醫藥大學學報，2011，25(1):56-58.

［4］ 方肇勤主編.辨證論治實驗方法學——實驗小鼠診法和辨證［M］.上海:上海科學技術出版社，2006.

［5］ 方肇勤主編.大鼠/小鼠辨證論治實驗方法學［M］.北京:科學出版社，2009.

［6］ 方肇勤.中醫辨證標準制定的若干關鍵問題［J］.上海中醫藥雜志，2006，40(1):11-13.