采用唾液淀粉酶和D-木糖排泄率對利血平脾虛證模型的評價研究*

李 燦，張海艇，陳玉龍

中醫(yī)動物模型是開展中醫(yī)證候及中藥新藥實驗研究的重要方法之一，已成為中醫(yī)科研方法體系的一個重要組成部分，但是如何對所建立的動物模型進行評價，是中醫(yī)證候模型研究的難點。

本研究應用此指標對最常用的中醫(yī)動物模型利血平脾虛證模型進行了評價，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

SD雄性大鼠44只，體重100g～140g，廣東省實驗動物中心提供(合格證號SCXK(粵)2008-0002)，適應性飼養(yǎng)至平均體重300g左右時開始實驗。

1.2 試劑

利血平注射液為廣東邦民制藥廠有限公司出品(批號080813)，生理鹽水為太極集團西南藥業(yè)股份有限公司(批號08080017)，冰乙酸廣州市番禺力強化工廠(批號20070803-3)，可溶性淀粉、碘化鉀為天津大茂化學試劑廠，Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4、碘酸鉀、生理鹽水為廣州化學試劑廠，苯甲酸為廣州星群制藥廠，以上試劑均為分析純。

1.3 儀器

H-600E-M型透射電鏡(日本 HITACHI公司);DY89-1型電動勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Uvmini-1240紫外分光光度計(島津制作所);DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.4 分組和造模

雄性SD大鼠自由飼養(yǎng)至300g左右，隨機分為正常組20只、模型組大鼠24只，模型組大鼠皮下注射0.5mg/kg/d利血平注射液8d;正常組大鼠注射等量生理鹽水8d。第9天正常組隨機處死10只大鼠，模型組大鼠12只，其余大鼠正常飼養(yǎng)30d。

1.5 標本取材

唾液取材方法:用2%戊巴比妥鈉以3ml/kg劑量麻醉后，待其稍清醒處于嗜睡狀態(tài)容易控制時，用帶塑料套管的注射針頭在大鼠口腔內部兩側抽取唾液10min，等大鼠稍清醒時用10%冰乙酸溶液20μl刺激大鼠舌尖1次/min，共刺激30min，在刺激的過程中同時抽取唾液10min，分別標記冷凍保存。

第9天和第39天，處死前用2%戊巴比妥鈉以3ml/kg劑量麻醉，麻醉后用剪刀沿左側耳后剪開一條線取下左側腮腺，一部分用3%戊二醛固定做電鏡檢查，剩余部分冷凍保存;縫合傷口，等大鼠稍清醒時用10%冰乙酸溶液20μl刺激大鼠舌尖1次/min，共刺激30min，取下右側腮腺，一部分用3%戊二醛固定做電鏡檢查，剩余部分冷凍保存。冷凍保存部分用以檢測其他指標。

1.6 檢測指標

1.6.1 一般狀態(tài) 每日觀察記錄各組大鼠的體重、攝食量、精神狀態(tài)、活動情況、大便性狀和毛發(fā)光澤度。

1.6.2 唾液淀粉酶的活性和唾液流量檢測唾液淀粉酶活性檢測采用碘比色法［3］，具體方法如下:各玻璃管加入0.04%可溶性淀粉溶液1ml，37℃恒溫水浴3min，空白管加入0.01ml水，樣品管加入唾液10μl混勻，37℃ 水浴 7.5min，全部管中加入1ml碘應用液，在波長660nm處用分光光度計測各管的OD值。

淀粉酶活性的計算方法:淀粉酶單位/100ml=(對照管 OD值-測定管的 OD值)/對照管 OD值 ×1600;酸刺激前后唾液淀粉酶活性(sAA)活性比值=酸刺激后sAA活性單位/酸刺激前sAA活性單位;刺激前流量比=刺激后流量/刺激前流量;刺激前后總sAA活性比值=(酸刺激后sAA活性單位×刺激后流量)/(酸刺激前sAA活性單位×刺激前流量)。

1.6.3 腮腺淀粉酶檢測 用4℃預冷的勻漿器在預冷的PBS緩沖液中按5ml/g組織的量勻漿腮腺組織;在4℃ 14000×g離心5min，取上清。檢測方法如上。

1.6.4 檢測尿D-木糖排泄率 造模結束后所有大鼠禁食不禁水12h后，每只大鼠灌胃3%D-木糖4ml，收集5h尿液。參考文獻［4-5］用對溴苯胺法測定尿 D-木糖排泄率:每例取0.5ml尿液樣本，雙蒸水稀釋10倍后加入2%對溴苯胺溶液2.5ml，取濃度為1mg/ml的 D-木糖溶液，依次倍比稀釋制作標準曲線，樣本管和標準管置70℃恒溫水浴箱10min，然后室溫放置70min，以分光光度計在波長520nm下檢測。

木糖排泄率(%)=［(根據標準曲線所計算濃度(mg/mL)×尿總量 mL×尿液稀釋倍數/灌胃木糖量)］ ×100% 。

1.6.5 大鼠腮腺組織病理學檢查 大鼠麻醉后用剪刀沿左側耳后剪開一條線，取下左側腮腺，4℃生理鹽水清洗后置中性甲醛溶液固定。固定12h后，經梯度酒精脫水、二甲苯固定后石蠟包埋，切片HE染色做病理組織學觀察。

1.6.6 電鏡下觀察酶原顆粒數量 固定、包埋，在解剖顯微鏡下修塊，切半薄切片，HE染色。在解剖顯微鏡下和普通顯微鏡下定位，超薄切片，電子染色、漂洗，干燥后電鏡下放大100000倍觀察。

1.7 統計學處理

實驗數據用SPSS11.0統計軟件進行處理，計量資料2組比較用t檢驗，實驗數據以珋x±s表示。

2 結果

2.1 利血平脾虛模型動物觀察

大鼠一般狀態(tài):大鼠注射利血平造模后，扎堆懶動，爛便，毛色粗糙，食量減少，體重下降(與正常組比較:P＜0.01);造模第8天停藥后，造模大鼠食量增加，體重逐漸回升，第39天正常組與實驗組無差別(見圖1)。

圖1 2組動物體重變化

2.2 尿D-木糖排泄率

表1顯示，在造模前、第9天(造模結束)、第23天、第39天4次檢測各組大鼠尿D-木糖排泄率。在造模前模型組、正常大鼠木糖排泄率無差異(與正常組比較P＞0.05);第9天模型組與正常組大鼠木糖排泄率明顯降低(與正常組比較P＜0.01);在第23天模型組與正常組大鼠木糖排泄率仍降低(與正常組比較P＜0.05);第39天模型組木糖排泄率逐漸回升，但仍低于正常組(與正常組比較P＜0.05)。

表1 尿D-木糖排泄率(珋x±s，%)

2.3 唾液流量及唾液淀粉酶

2.3.1 酸刺激前后2組大鼠的唾液流量 表2顯示，造模第9天和第39天，2組大鼠在酸刺激后唾液流量與刺激前相比均顯著升高，但2組大鼠間無顯著差異。

表2 正常組和模型組大鼠酸刺激前后唾液流量比較((μl)珋x±s)

2.3.2 酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值變化每組10只大鼠，比較實驗第9、23、39天的酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值，發(fā)現實驗組在第9天酸刺激前后唾液淀粉酶活性顯著降低，第39天2組無顯著意義。

表3 酸刺激前后酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值

2.3.3 大鼠腮腺內淀粉酶活性 第9天，2組大鼠腮腺內sAA在酸刺激前沒有顯著差異，但是模型組大鼠在酸刺激后sAA高于正常組，刺激后的下降率低于正常組。第39天，給予模型組大鼠酸刺激后腮腺sAA仍高于正常組大鼠。

表4 2組大鼠腮腺內淀粉酶活性(活性單位/g組織)(珋x±s)

2.4 各組大鼠腮腺組織形態(tài)學觀察

第9天和39天，各組大鼠腮腺組織病理學檢查均未發(fā)現各組大鼠腮腺組織有明顯病理改變，鏡下所見腺體細胞無腫大，間質未見充血水腫，腺管周圍及纖維間質中無淋巴細胞和漿細胞浸潤，腺泡未見萎縮、消失，腺管上皮未見增生水腫，管腔內未見充滿壞死細胞和滲出物(見圖2)。

2.5 酸刺激下腮腺酶原顆粒

第9天顯示，2組大鼠腮腺組織內酶原顆粒在酸刺激前沒有顯著差異，在刺激后正常組顯著下降，模型組殘留的酶原顆粒數量顯著高于正常組(詳見圖3)。

第39天，觀察酸刺激后各組大鼠腮腺內殘余的酶原顆粒，模型組相對正常組殘余的酶原顆粒數量較多(見圖4)。

3 討論

用利血平法建立脾虛證動物模型由北京市中醫(yī)研究所首創(chuàng)［6］，是目前中醫(yī)藥研究最常用的動物模型之一。一般情況下，動物模型有自然恢復現象，利血平脾虛證動物模型也不例外。我們的實驗表明，利血平脾虛大鼠模型在造模剛結束時動物出現飲食減少、體重下降、便溏、消瘦、懶動、兩眼瞇縫等類似脾虛證的表現，這些癥狀比較符合脾虛證候，但是在停用利血平后，各種癥狀特別是體重有所恢復，雖然仍有所偏低，但從單一癥狀上已很難說明動物還是脾虛證候。

圖2 光鏡下觀察各組大鼠腮腺組織的形態(tài)學改變(HE染色 ×400)

圖3 第9天正常組和模型組大鼠腮腺組在透射電鏡觀測腮腺組織酶原顆粒(×105)

圖4 第39天大鼠腮腺組織在透射電鏡觀測腮腺組織酶原顆粒(×105)

脾氣虛證是以消化系統為中心的多系統、多器官功能障礙綜合癥候群，以消化、運動、吸收功能障礙為主。木糖是一種五碳糖，通常在血液中不存在，主要在小腸上段吸收，所以D-木糖排泄率能夠反映空腸的吸收功能狀態(tài)。中醫(yī)認為，脾與唾液分泌關系密切，是重要的消化腺。研究發(fā)現，脾虛患者在酸刺激下唾液淀粉酶活性(sAA)比值下降。1986年在鄭州召開的全國虛證研究會議和中藥新藥臨床研究指導原則確定，木糖吸收試驗和酸刺激下sAA為脾虛證診斷的參考指標，目前這2項指標己被廣泛應用于脾虛證的研究中。因此，課題組采用反映小腸吸收功能的D-木糖排泄率和反映消化酶分泌的唾液淀粉酶為主要評價模型的指標。

本研究表明，模型組動物在造模結束時D-木糖排泄率顯著下降，并一直持續(xù)到模型后30d，說明利血平法脾虛模型在小腸吸收方面從造模結束一直到模型后30d仍存在功能障礙。造模結束后，酸刺激前后的唾液分泌流量沒有差異，而唾液淀粉酶活性比值較正常大鼠相比顯著降低，滯留腮腺的唾液淀粉酶酸前后比值增高，說明脾虛模型大鼠存在唾液淀粉酶分泌障礙，這與臨床觀察相一致。在造模后30d，唾液淀粉酶分泌障礙有所恢復，但仍然存在。

在本研究中，我們用直接抽取和唾液腺勻漿2種方法測定檢測酸刺激前后唾液淀粉酶分泌情況，發(fā)現唾液腺勻漿方法得到的數據更為穩(wěn)定。

為進一步研究唾液淀粉酶分泌障礙機制，我們對利血平脾虛證模型腮腺進行普通病理和電鏡觀察，發(fā)現在普通病理上沒有變化。電鏡超微結構可知，脾虛證模型酶原顆粒較多，特別是在酸刺激下，模型組殘留的酶原顆粒數量顯著高于正常組。表明動物唾液淀粉酶分泌障礙不是由于炎癥或者纖維化等所引起，但其機制有待于進一步研究。

總之，本實驗應用D-木糖排泄率和酸刺激前后唾液淀粉酶分泌比值對利血平脾虛模型大鼠進行了評價，發(fā)現該模型符合脾虛證診斷標準，并且可以在一段時間內(造模后1d～30d)用來評價藥物療效。D-木糖排泄率比酸刺激前后唾液淀粉酶分泌比值更靈敏和方便。

［1］ 1986年全國中兩醫(yī)結合虛證與老年病研究專業(yè)委員會.中醫(yī)虛證辨證參考標準［S］.中西醫(yī)結合雜志，1986，6(10):598.

［2］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.中藥新藥臨床研究指導原則［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:93-95.

［3］ 李儀奎.中藥藥理實驗方法學［M］.第2版.上海:上海科學技術出版社，2006:239-245.

［4］ 張 翥，馬繼偉，李寅超.溢尿停對實驗性脾虛SD大鼠胃腸功能的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜，2004，31(8):703-704.

［5］ 張愛郁，白德貞，張延英，等.慢性腹瀉161例尿 D-木糖測定的臨床研究［J］.甘肅中醫(yī)學院學報，1993，10(4):13-14.

［6］ 北京市中醫(yī)研究所.有關脾氣虛實質的臨床觀察和實驗研究［J］. 中華醫(yī)學雜志，1982，62(1):22.