低氧訓練對大鼠骨骼肌HIF-1 mRNA及鐵轉運蛋白表達的影響

李海洲，劉玉倩，王海濤，程康康，孫 娟，呂 軍，宋文靖，楊 杰

鐵參與機體氧的轉運、貯存與利用及ATP合成等許多生理過程。氧氣是維持人體正常生命活動的關鍵因素，血紅蛋白和肌紅蛋白與氧氣的運輸和擴散有著密切的關系，因此，機體內氧的含量直接影響著鐵蛋白的儲存［25］。運動訓練和低氧環境均可改變機體鐵狀態，其調節機制已經成為國際研究熱點。低氧訓練能發揮缺氧和運動雙重刺激，促進機體紅細胞生成，提高機體運載及利用氧的能力［1］。近年來的研究表明，高原低氧刺激引起機體需鐵量增加，促使骨骼肌的鐵動員發生明顯變化［29］。因此，骨骼肌作為運動中利用氧和鐵的重要組織［5］，低氧刺激下可引起骨骼肌中鐵代謝發生適應性變化，從而進一步影響機體運動的能力［4］。

低氧誘導因子1（hypoxia-inducible transcription factor-1，HIF-1）是機體低氧應答的關鍵因子，近年來發現它能在低氧下通過誘導多種與鐵代謝相關蛋白，如一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOs）、血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1，HO-1）、促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、DMT1、TfR1等的表達進而影響機體的造血、鐵代謝等功能［8，27］。同時，有研究表明，低氧可能會引起骨骼肌的鐵含量的變化，對運動成績造成影響［13］。低氧訓練下骨骼肌鐵吸收蛋白轉鐵蛋白受體1（transferring receptor 1，TfR1）和二價金屬離子轉運體（divalent metal transporter1，DMT1），骨骼肌鐵釋放蛋白膜鐵轉運蛋白1（ferroportin1，FPN1）［30］受整個機體鐵狀態影響，進而使骨骼肌中鐵含量發生變化。然而，單純低氧和低氧結合運動對骨骼肌的鐵代謝影響是否存在差異，低氧對骨骼肌鐵代謝的具體調節機制尚需探索。本研究將通過檢測低氧訓練中骨骼肌HIF-1mRNA、鐵轉運蛋白的表達以及骨骼肌組織鐵的變化，闡明低氧以及低氧訓練對骨骼肌鐵代謝的影響機制，為進一步研究低氧訓練對骨骼肌鐵代謝的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠32只（河北醫科大學實驗動物中心提供），體重250±10g，標準嚙齒類動物，飼養籠分籠喂養，自由進食和飲水，濕度50％±5％，室溫22℃～25℃，每日自然光照，所有動物實驗前均無跑臺運動史。

1.2 訓練方案

大鼠隨機分成4組：常氧安靜組（normal control，NC）、常氧運動組（normal exercise，NE）、低氧安靜組（hypoxia control，HC）、低氧運動組（hypoxia exercise，HE）。每組各8只。采用常壓低氧倉（氧濃度13.6％，相當于3 500m海拔）［6］，低氧安靜組和低氧運動組每天在低氧艙安靜呆8h，常氧運動的強度為從21m/min遞增至25m/min，每周增1m/min，1h/天，6天/周。坡度為0°，運動5周。

1.3 取材

最后一次處理24h后安靜常氧時取材，采用戊巴比妥鈉（0.4％，1ml/100g）麻醉大鼠，用去離子水（Mill-Q，France）配制的4℃生理鹽水升主動脈快速灌流，取腓腸肌外側頭，迅速投入液氮中保存以備進行測定。

1.4 原子吸收法測定大鼠骨骼肌總鐵含量

取1.0～5.0g骨骼肌放于錐形瓶中，加入25ml混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1），應用電熱消解儀（EHD36，LABTECH）進行消解，冷卻后取上清備用。取Fe標準液及樣品液，用原子吸收分光光度計（AA240FS，VARIAN）進行測定，原子吸收分析軟件（spectrAA5.1，VARIAN）進行分析。

1.5 RT-PCR檢測大鼠骨骼肌HIF-1mRNA的表達變化

采用RT-PCR檢測大鼠骨骼肌細胞中HIF-1mRNA的表達：取100μg組織加1ml Trizol Reagent（Invitrogen，USA）勻漿器勻漿，提取總DNA。測濃度及純度后用反轉錄試劑盒（PrimeScirptTM RT reagent Kit，TaKaRa）在PCR儀（Eppendorf AG 22331，Gene company Limited）中進行反轉錄（37℃15min，85℃5s），總體系為20μL，反轉錄產物在冰上配制PCR反應液。在RT-PCR管中加入2μL反轉錄后的cDNA，上下游引物（上海生工）各1μL，10％PCR Buffer 2μL ，10mM DNTP 2μL，Taq酶0.2μL（TaKaRa），DEPC水補至20μL。設定HIF-1mRNA擴增反應循環條件為：95℃4min；94℃45s，56℃45s，72℃1min（34個循環）；72℃10min［3］。放置PCR儀中進行擴增。取5μL擴增產物用于1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析（溴化乙錠EB染色），同時以β-actin為內參，用凝膠成像系統（Fujifilm Las-4000）掃描圖像，Multi Gauge V3.1分析軟件進行分析，最終統計HIF-1與β-actin的亮度比值。引物設計序列［10］如表1所示。

表1 本研究RT-PCR引物序列一覽表

1.6 Western Blot檢測大鼠骨骼肌DMT1、FPN1、TfR1的表達

提取骨骼肌總蛋白，Bradford法測定總蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳：10％分離膠，4％濃縮膠，上樣量為50μL，同時加入Marker，恒壓電泳100 V，20min，再200V，45min；恒流轉至NC膜300mA，45min。5％脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入DMT1（IRE）（1∶5 000）、DMT1（non IRE）（1∶5 000）、TfR1（1∶1 000）、FPN1（1∶5 000）兔抗大鼠蛋白的（ADI，San Antonio，TX）一抗，4℃過夜；TBST（20Mm Tris-Cl，pH 7.6，137 mMNaCL，0.1％Tween-20）洗膜后加入1∶5 000辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗［山羊抗兔IgG（H+L）］，室溫搖動孵育1h：加入化學發光底物（Super signal west pico trial kit，PIERCE，USA）發光；用凝膠成像系統（Fujifilm Las-4000）掃描圖像，Multi Gauge V3.1分析軟件進行分析。TBST洗膜厚奶粉室溫封閉，再加入β-actin抗體再進行發光。最終統計每一種目的蛋白與β-actin的OD比值。

1.7 統計學分析

所有數據采用SPSS 18.0進行組間比較，采用雙因素方差分析（UNIANOVA）和單因素方差分析（One-Way ANOVA），實驗結果以平均數±標準差（±SD）表示，顯著性水平為P＜0.05，非常顯著性水平為P＜0.01。

2 結果

2.1 低氧訓練對大鼠腓腸肌總鐵含量的影響

結果顯示（表2），與常氧安靜組相比，各組大鼠腓腸肌總鐵含量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；而低氧運動組大鼠腓腸肌總鐵含量明顯高于常氧運動組和低氧安靜組（P＜0.05）。

表2 本研究低氧訓練對大鼠腓腸肌總鐵含量的影響一覽表（n=8）

2.2 低氧訓練對大鼠腓腸肌HIF-1mRNA表達的影響

圖1 本研究大鼠腓腸肌HIF-1mRNA表達的比較示意圖（n=8）

低氧安靜組和低氧運動組大鼠骨骼肌中HIF-1mRNA的表達顯著高于常氧安靜組和常氧運動組（P＜0.01；NC：0.53±0.13；NE：0.50±0.13；HC：0.96±0.12；HE：0.98±0.16；圖1）。

2.3 低氧訓練對大鼠骨骼肌鐵轉運蛋白表達的影響

NC組：DMT1（IRE）：0.55±0.03，DMT1（nonIRE）：0.57±0.08，TfR1：0.65±0.04，FPN1：0.55±0.016；NE組：DMT1（IRE）：0.73±0.02，DMT1（nonIRE）：0.73±0.08，TfR1：0.82±0.05，FPN1：0.45±0.02；HC組：DMT1（IRE）：0.72±0.04，DMT1（nonIRE）：0.70±0.09，TfR1：0.81±0.07，FPN1：0.46±0.07；HE組：DMT1（IRE）：0.95±0.11，DMT1（nonIRE）：0.91±0.04，TfR1：0.97±0.09，FPN1：0.70±0.05（圖2）。

結果顯示，與常氧安靜組相比，各組大鼠的鐵吸收蛋白（DMT1、TfR1）均顯著性升高（P＜0.05，P＜0.01），常氧運動組和低氧安靜組的鐵釋放蛋白（FPN1）明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），低氧運動組明顯升高（P＜0.01）。低氧運動組鐵吸收蛋白（DMT1、TfR1）和鐵釋放蛋白（FPN1）均非常顯著高于常氧運動組和低氧安靜組（P＜0.01）。

圖2 大鼠骨骼肌鐵轉運蛋白表達的比較示意圖（n=8）

3 討論

3.1 低氧訓練與骨骼肌鐵代謝

本實驗中不同組別大鼠承受的運動刺激不同，其生理機能會發生不同的適應性變化，骨骼肌是運動中利用鐵的重要組織，骨骼肌的鐵代謝也會因運動強度的不同隨之改變［5］。骨骼肌細胞的鐵代謝包括鐵的攝取和鐵的釋放，骨骼肌主要通過轉鐵蛋白受體介導的內吞機制攝取鐵，轉鐵蛋白（transferrin，Tf）首先與細胞膜上的轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）結合，然后受體-轉鐵蛋白-鐵復合物通過細胞的內吞作用進入肌細胞內。骨骼肌細胞膜上除TfR1外還有二價金屬離子轉運體1（divalent metal transporter l，DMT1）參與鐵的攝取［21，16］。膜鐵轉運蛋白1（ferroportin 1，FPN1）有將鐵從骨骼肌細胞從細胞內釋放至細胞外的功能［11，18］。本實驗結果顯示，常氧運動組和低氧安靜組大鼠鐵吸收蛋白TfR1和DMT1的兩種亞型均明顯升高、鐵釋放蛋白FPN1明顯下降。本實驗組前期研究發現，適度運動有利于骨骼肌鐵吸收［30］，同時有研究證明，單純的低氧刺激會增加細胞DMT1和TfR1蛋白的表達，這與DMT1和TfR1是低氧誘導產生的HIF-1的靶基因有關［2，23］。低氧運動組大鼠與各組比較TfR1和DMT1明顯升高、FPN1明顯升高，分析其原因是低氧訓練加大了機體的負荷，為了促進紅細胞的生成［27］，機體鐵的需要量增加，骨骼肌鐵吸收能力提高的同時，鐵釋放能力也升高，釋放更多的鐵到機體中用于Hb的合成。

由于骨骼肌鐵轉運蛋白的明顯變化，其總鐵含量也發生相應變化，與常氧安靜組對比，各組大鼠腓腸肌鐵含量明顯增加，低氧訓練組與各組比較腓腸肌鐵含量也顯著增加。本實驗組前期研究發現，不同強度的運動會造成機體鐵分布的變化，適度的運動會增加骨骼肌中鐵儲存，有利于骨骼肌的鐵利用［5］。低氧刺激能增加骨骼肌鐵儲存，可能與滿足肌肉收縮有關［7，12］，同時發現，HIF-1能刺激離體損壞的肌細胞（C2C12）再生［9］，因此，低氧下骨骼肌用于細胞再生的鐵增加也是組織鐵增加主要的原因［17］。低氧運動組大鼠鐵吸收與鐵釋放明顯增加，同時骨骼肌鐵儲存也明顯增加，這說明低氧訓練不僅有利于骨骼肌功能的改善，并能促進骨骼肌的鐵利用，在維持機體鐵穩態中起到積極作用。

3.2 低氧訓練對大鼠骨骼肌鐵轉運蛋白影響的可能機制

低氧訓練影響機體鐵代謝的途徑較多，但目前尚缺乏直接證據證明低氧通過何種途徑調節骨骼肌鐵轉運蛋白的表達。近年研究表明，HIF在低氧誘導的機體適應中發揮重要作用［31］。實驗結果表明，低氧對照組和低氧運動組其HIF-1mRNA明顯升高，這說明低氧可顯著增加骨骼肌HIF1的表達。低氧訓練能增加大鼠腓腸肌DMT1（IRE）的表達，這可能是低氧時機體可以通過HIF/HRE系統調節鐵調節蛋白1（iron regulatory proteins 1，IRP1）的表達，IRP1作為HIFs的靶基因，HIFs能夠上調IRP1，通過IRP1表達的變化進一步影響具有鐵反應元件（iron response element，IRE）鐵轉運相關蛋白［22］。FPN1在適度的運動和低氧暴露下表達下降，而低氧訓練使FPN1表達顯著上升。FPN1主要受肝臟分泌的抗菌多肽hepcidin負調控，hepcidin對骨骼肌的鐵代謝也起重要的調節作用，hepcidin可與骨骼肌或心肌細胞膜上的FPN1結合，降低鐵的釋放［14，20］。而hepcidin受到最新發現的鐵調素調節子跨膜絲氨酸蛋白酶6（transmenbrance serine proteases 6，TMPRSS6）的抑制［15］。TMPRSS6受低氧下產生的關鍵信號因子HIF-1的調節［26，19］。

骨骼肌鐵轉運蛋白的變化直接影響骨骼肌中的總鐵含量，然而，過度的低氧暴露或低氧訓練并不利于骨骼肌的功能，骨骼肌中鐵含量流失或超載都會引起骨骼肌功能的下降。長時間高原條件下人體骨骼肌FPN1mRNA表達增加，這會增加鐵釋放［24］。因此，長時間的低氧暴露會影響骨骼肌細胞的代謝和有氧氧化能力及肌肉體積，造成細胞損傷，影響了肌細胞的活性［28］。但也有研究發現，運動性低血色素的大鼠在低氧環境下（14.5％）恢復3周后，血清鐵（serum iron，SI）、血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）、總鐵結合力明顯升高，血清轉鐵蛋白受體（serum transferring receptor，sTfR）下降也說明低氧暴露可以促進血清鐵代謝，有利于運動性低血色素恢復，對機體起到良好的恢復作用［1］。本實驗對低氧訓練引起的骨骼肌鐵轉運蛋白的變化進行了初步研究，低氧訓練的方式、強度還需進一步完善，而低氧訓練對機體鐵代謝以及骨骼肌鐵代謝影響的具體機制還需深入探討。

4 結論

大鼠適度運動和單純的低氧暴露均能增加骨骼肌的鐵貯存以滿足運動中機體對鐵的需求，有利于骨骼肌運動能力的改善。而低氧訓練在促進骨骼肌鐵吸收的同時，鐵的釋放也顯著增加，這加強了骨骼肌循環利用鐵的能力，從而進一步滿足整個機體其他組織對鐵的需要，維持機體鐵穩態。同時發現DMT1和TfR1作為HIF-1的靶基因，低氧訓練中HIF-1mRNA表達增加可能是影響骨骼肌鐵轉運蛋白表達的原因之一。

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