羅漢果快繁技術(shù)研究

鄺瑋琦，饒力群，李 倩，聶 凱，彭國平

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128）

羅漢果，學名“光果木鱉”[Siraitia grosvenori（Swingle）C.Jeffrey]，為葫蘆（Cucurbiataceae）羅漢果屬多年生草質(zhì)藤本植物，主產(chǎn)地為桂林龍勝、龍脊、永福、臨桂等地區(qū)，目前貴州、湖南、江西等省都有移栽。羅漢果主要成分羅漢果苷Ⅴ，其甜度是蔗糖的425倍[1]，而其熱量幾乎為零。最近研究表明，羅漢果中的羅漢果苷和羅漢果醇具有清除自由基抗脂質(zhì)過氧化和抗糖尿病的作用[2]。20世紀80年代林榮等開始對羅漢果組培技術(shù)進行研究。付長亮和馬小軍[5]利用莖尖培養(yǎng)得到脫毒的羅漢果組培苗。本實驗首先通過湖南本土的適宜性移栽，選取生長旺盛的羅漢果植株的莖段作為外植體得到脫毒的無菌苗。利用正交設(shè)計的方法研究不同外源激素添加物對羅漢果繼代增殖的的影響，并且利用SPSS17.0軟件對正交實驗進行設(shè)計和方差分析，以期篩選出適合羅漢果莖段增殖和生根的培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料為羅漢果脫毒繼代4代瓶苗。

1.2 方法

將羅漢果瓶苗莖段剪成1～2 cm帶芽莖段，接入含50mL培養(yǎng)基的240 mL培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶接種2個莖段。光照12 h/d，光照強度3 000 lx，溫度26±2℃，培養(yǎng)30 d后計數(shù)。

1.2.1 單因素實驗 以MS+BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂粉 5 g/L為基本培養(yǎng)基，以6-BA，IBA，NAA，蔗糖作為單因素條件,各設(shè) 5 個水平：6-BA（0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L），IBA （0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L），NAA（0.01、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L），蔗糖（10、20、30、40、50 g/L），分別考察其對脫毒苗莖段的影響。

1.2.2 羅漢果莖段增殖正交實驗 以MS為基本培育基，4 因素各設(shè)置 3 個水平：6-BA（0.3、0.5、0.7 mg/L），IBA（0.1、0.2、0.3 mg/L），NAA（0.01、0.05、0.1 mg/L），蔗糖（20、30、40 g/L）。篩選出最適合羅漢果莖段不定芽的增殖培養(yǎng)基，如表1所示。

表1 羅漢果莖段增殖正交設(shè)計L9（34）水平表

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS17.0分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到方差結(jié)果，根據(jù)極差篩選出最佳的增殖培養(yǎng)基配方。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)的無菌苗剪成雙節(jié)莖段接種于下列三種生根培養(yǎng)基中：①1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性碳0.01%+瓊脂5%+蔗糖 30%，pH=5.8；②1/2MS+6-BA 0.1mg/L+IBA 0.5 mg/L+活性碳0.01%+瓊脂5%+蔗糖30%，pH=5.8；③1/2MS+NAA 0.1mg/L+活性碳 0.01%+瓊脂5%+蔗糖30%，pH=5.8。每種培養(yǎng)基接種20個雙節(jié)莖段，培養(yǎng)30 d后記錄生根率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對羅漢果莖段增殖的影響

2.1.1 不同6-BA濃度對羅漢果莖段增殖的影響不同6-BA濃度對羅漢果莖段增殖的影響如表2所示。當6-BA濃度為0.1～1.0mg/L時，隨著激素濃度的增加，莖段的增殖倍數(shù)也增加，長勢都很好，

表2 不同6-BA濃度對羅漢果莖段增殖的影響

但當6-BA濃度上升到3.0mg/L時，羅漢果莖段和葉片枯黃，葉片畸形，綜合比較以0.5 mg/L為最佳濃度，濃度高于1.0mg/L不利于組培苗的遺傳穩(wěn)定。當6-BA濃度低于0.1mg/L時不能有效誘導(dǎo)細胞分裂，增殖倍數(shù)低。

2.1.2 不同IBA濃度對羅漢果莖段增殖的影響 不同IBA濃度對羅漢果莖段增殖的影響如表3所示。當IBA濃度小于0.1mg/L時，不能有效刺激莖段細胞生長，莖段長勢差。當IBA濃度大于0.1mg/L時，增殖倍數(shù)沒有很大變化，但當IBA濃度大于0.3 mg/L時葉片比較多，而且大，不利于莖段的增殖。綜合比較以0.2mg/L為最佳濃度。

表3 不同IBA濃度對羅漢果莖段增殖的影響

2.1.3 不同NAA濃度對羅漢果莖段增殖的影響不同NAA濃度對羅漢果莖段增殖的影響如表4所示。當NAA濃度高于0.1 mg/L時會使羅漢果的營養(yǎng)生長過盛，葉片多而且大，并且莖段開始有生根的趨勢，不利于莖段的增殖。綜合比較以0.1mg/L為最佳濃度。

表4 不同NAA濃度對羅漢果莖段增殖的影響

2.1.4 不同蔗糖濃度對羅漢果莖段增殖的影響 不同蔗糖濃度對羅漢果莖段增殖的影響如表5所示。蔗糖作為碳源對羅漢果莖段影響顯著，濃度低于20mg/L時不足以提供生長所需的碳源，葉片變成黃色。同時，蔗糖也起到了調(diào)節(jié)滲透壓的作用，當蔗糖濃度高于30mg/L時，都會引起滲透壓處于超最適水平[3]。因此，以蔗糖濃度30 g/L為最佳濃度。

表5 不同蔗糖濃度對羅漢果莖段增殖的影響

2.2 正交實驗

2.2.1 實驗結(jié)果 正交實驗的結(jié)果（表6）顯示了各因素不同水平的極差，從表6中可知Ra=3.083；Rb=3.250；Rc=0.916；Rd=3.584。4因素對羅漢果莖段增殖的影響大小依次是：蔗糖>IBA>6-BA＞NAA。

表6 羅漢果莖段增殖正交設(shè)計L9（34）實驗結(jié)果

正交結(jié)果分析顯示：6-BA K3最大，IBA K1最大，NAA K3最大，蔗糖K1最大，所以最佳培養(yǎng)基配方為A3B1C3D1，即MS+6-BA 0.7mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L+蔗糖 20 g/L+瓊脂 5 g/L，pH=5.8（在試驗出現(xiàn)的處理中）。

2.2.2 方差分析 在利用SPSS進行正交實驗方差分析時，無空白的正交實驗需要利用重復(fù)實驗得到誤差，且不能利用實驗的平均值作為重復(fù)變量，而要用原始數(shù)據(jù)[4]。在實驗中重復(fù)4次，誤差從重復(fù)實驗中得到。在α=0.05時，6-BA，IBA和蔗糖對莖段的增殖影響顯著（p<0.05），NAA對實驗影響不顯著（p>0.05），NAA作為實驗因子可以忽略。

2.3 生根培養(yǎng)實驗結(jié)果

按照1.2.4的方法接種1周后，實驗結(jié)果表明：①號培養(yǎng)基中的莖段長出根，根細而長，生根率達到95%，30 d后生根情況如圖1所示。10 d后接種在②、③號培養(yǎng)基的莖段中的根被誘導(dǎo)出來。②號培養(yǎng)基中的根粗而短，30 d后生根情況如圖2所示，生根率達到80%。③號培養(yǎng)基中的莖段底部形成的愈傷組織比較小，根細而長并且分支較多，生根率達到85%，30 d后生根情況如圖3所示。

3 結(jié)論與討論

在對羅漢果莖段進行擴繁時，應(yīng)選擇繼代次數(shù)小于8代的繼代苗的莖段，有利于組培苗的遺傳穩(wěn)定性，用莖段作為外植體時更有利于組培苗的穩(wěn)定性。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中關(guān)鍵物質(zhì)，細胞分裂素6-BA和生長素NAA、IBA對芽的誘導(dǎo)和生長發(fā)育起重要作用，其中細胞分裂素是一類較活躍的植物激素，它不僅促進植物細胞的分裂和增大，而且在芽的分化、葉綠體的發(fā)育，養(yǎng)分的運輸和分配、細胞衰老的抑制等方面都表現(xiàn)顯著的效果[7-10]；而植物生長素調(diào)節(jié)植物生長，尤其能刺激莖內(nèi)細胞縱向生長并抑制根內(nèi)細胞縱向生長的一類激素，它可影響莖的向光性和背地性生長。

本實驗分別對6-BA、IBA、NAA、蔗糖做單因素的水平實驗，其中6-BA、IBA、蔗糖對羅漢果莖段的增殖有顯著影響，NAA對羅漢果莖段增殖的影響不顯著，4因素對羅漢果莖段增殖的影響大小依次是：蔗糖>IBA>6-BA>NAA。與NAA相比，IBA能更好地促進細胞分裂，誘導(dǎo)芽的形成和促進芽的生長。綜合各項指標確定最優(yōu)培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.7mg/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂5 g/L，pH=5.8。本文與付長亮等[5]的羅漢果組織培養(yǎng)結(jié)果有差異，可能是由于材料不同和選材時間不同所致。莫長明等[6]利用6-BA和NAA的單一組合作為莖段增殖的標準配方，本研究也發(fā)現(xiàn)6-BA和IBA搭配更有利于繼代增殖培育。

研究得出最佳生根培養(yǎng)基為：1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性碳0.01%+瓊脂5%+蔗糖30%，pH=5.8；6-BA和NAA的搭配能更好地誘導(dǎo)生根，生根率達到95%，添加NAA能促進根的分化，7 d后長出根，粗壯且分支多；與沒有添加IBA的相比，添加IBA的培養(yǎng)基根數(shù)更多，說明IBA能促進生根。

[1] Matsumoto K,Kasai R,Ohtani K.Minor cucurbitane-glycosides from fruits of Siraitia Grosvenori(Cucurbitaceae)[J].Chem Pharm Bull:1990（38）:2030-2032.

[2] 戚向陽，陳維軍，張俐勤，等.羅漢果皂甙清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化作用的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39（2）：382-388.

[3] Beru To M,Lanteri L,Porto Gallo.micropropagation of tree peony（Paeonia suff ruticosa）[J].Plant cell,Tissue and Organ culture,2004，（79）：249-255.

[4] 夏傳濤，袁秉祥.無空列正交實驗的設(shè)計及SPSS軟件的數(shù)據(jù)處理[J].數(shù)理醫(yī)藥學雜志，2006，1（19）：91-92.

[5] 付長亮，馬小軍.羅漢果脫毒苗的快速繁殖研究 [J].中草藥，2005，8（36）：1225-1229.

[6] 莫長明，白隆華.羅漢果組培苗繁育標準操作規(guī)程研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，9（19）：2092-2094.

[7] 王兆龍，曹衛(wèi)星.細胞分裂素對植物基因表達的調(diào)節(jié)[J].植物生理學通訊，2000，36（1）：82-87.

[8] 鞠 偉，程云燕，張 健.羅漢果研究概況綜述[J].廣西輕工業(yè)，2001，（4）：4-6.

[9] 何 康.中國農(nóng)業(yè)百科全書(農(nóng)作物卷，上)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1984.336-337.

[10]林 緯，黎起秦，彭好文,等.羅漢果組培苗種植存在問題及解決措施[J].廣西農(nóng)業(yè)科學，2003，（4）：74-75.

[11]劉世彪，田啟建，江德應(yīng)，等.羅漢果的人工授粉試驗及果實的營養(yǎng)成分分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學，2010，（10）：111-113.

[12]陳樹幫，林 源，張雨生.南藥羅漢果產(chǎn)業(yè)資源利用與探討[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2009，（8）：373-374.

[13]白先達，趙 洪，唐更生，等.氣象條件對羅漢果生長影響的分析[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2009，21（7）：113-116.

[14]林 榮，王秀琴，王潤珍.羅漢果莖段離體培養(yǎng)研究[J].廣西植物，1985，5（3）：273-277.