EGCG對惡性膠質瘤細胞MMP-9表達及活性的影響

陽文任 梁慶模

多形性膠質母細胞瘤（Glioblastoma Multiforme，GBM）是常見的中樞神經系統惡性神經上皮細胞腫瘤，占腦癌病例中一半以上。在世界范圍內，每年診斷出的此類病例大約有175，000人，大多數癌癥通過癌細胞擴散全身而導致死亡[1]。腫瘤細胞的侵襲和轉移是腦膠質瘤最重要的生物學行為，其中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類降解結締組織細胞外基質降解過程中必不可少的酶，幾乎能降解細胞外基質的所有成分。在腫瘤的轉移過程中起重要作用[2]。本研究試圖探討綠茶提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在人星形神經膠質瘤細胞系中，對佛波脂誘導的MMP-9表達有何影響，從而豐富EGCG的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

星形神經膠質瘤細胞系U87MG購自中國典型培養物保存中心（武漢）。Wizard DNA純化試劑盒為Promege 產品；DNA膠回收試劑盒購自北京博大泰克公司。DNA Marker DL15,000購自大連TaKara生物工程公司、100bp DNALadder購自北京鈞堯偉業生物技術公司；氨芐青霉素、鏈霉素購自華美公司。其余試劑主要購自上海生工生物工程公司和江蘇碧云天等公司。

1.2 神經膠質瘤細胞系U87MG的培養與EGCG處理

星形神經膠質瘤細胞系U87MG于無抗生素的含10% FBS的DMEM培養基，37℃、5% CO2的培養箱中培養。取U87MG傳代30～36h處于對數生長期的細胞(約70%～80%融合)，以每孔0.5×105細胞平均接種于6孔細胞培養板中，每孔體積1ml，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的環境中培養過夜，同時按實驗要求加入不同濃度(0、5、10、20μM)的EGCG，另每孔加100ng/ml的PMA。37℃，5% CO2條件下培養48h后，收集細胞和上清液。

1.3 明膠酶譜實驗

條件培養液經含2mg/ml明膠A和明膠B的聚丙烯酰胺凝膠（8%）中電泳。電泳結束后，凝膠置于含2.5%的 Triton X-100中振蕩洗脫3次，每次30min以去除SDS。然后將凝膠放入100 mL孵育液（100mM Tris-HCl，10mM CaCl2）37℃中孵育24h，經染色(0.5%考馬斯亮藍)、脫色后，用凝膠成像系統拍照。

1.4 免疫印跡

細胞處理結束后，采用總蛋白提取試劑盒提全細胞蛋白。用BCA方法定量后，100℃煮沸5min，取20μl蛋白用于SDSPAGE。電泳結束后，用半干轉印法轉膜，洗膜結束后用MMP-9多克隆抗體（Santa Cruz）孵育，洗膜，孵育二抗，ECL化學發光顯影。同時采用β-actin抗體作為內參。

1.5 RT-PCR

細胞處理結束后，用Trizol試劑提取總RNA。使用AMV 逆轉錄酶和隨機引物9聚體合成第一鏈cDNA。反應條件如下：94℃預變性5min，隨后95℃ 30s,60℃ 45s,72℃ for 30s。共30循環，最后在72℃下延伸7min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳并經凝膠成象系統成像。

2 結果

2.1 EGCG對PMA誘導MMP-9基因轉錄的影響

RT-PCR結果顯示，EGCG處理后，與對照組相比，MMP-9基因mRNA水平隨EGCG濃度的增高而降低（圖1A）。內參在所有時間段保持恒定（圖3B）。

圖1 EGCG對U87MG細胞中MMP-9基因轉錄的影響

2.2 EGCG對MMP-9蛋白表達的影響

Western blot證實，表明EGCG能抑制U87MG細胞MMP-9蛋白的表達，并隨著EGCG濃度的增加，其表達水平逐漸降低（圖2A）。β-actin在所有組中無明顯影響(圖2B)。

圖2 EGCG對U87MG細胞中MMP-9表達的影響

2.3 EGCG對PMA誘導MMP-9的酶活性的改變情況

取U87MG細胞與EGCG共孵育48h后的培養上清，以明膠為底物，酶譜檢測MMPs的表達及活性(見圖3)，表明EGCG能抑制PMA誘導的RU87MG細胞MMP-9的活性，且隨著EGCG濃度的增加，U87MG細胞MMP-9的酶活性減弱越明顯。

圖3 EGCG對PMA誘導RU87MG細胞MMP-9的酶活性影響

3 討論

膠質母細胞瘤是腦原發腫瘤中發病率最高、治愈率最低、治療效果最差的一類腫瘤。可發生于任何年齡，以成人多見。原發性腦膠質瘤的5年生產率約為20%，兒童期腫瘤的5年生存率預期為72%，主要是因為GBM等惡性膠質瘤的預后較差。在成年人，GBM 2年平均生存率只有10%～25%。GBM呈浸潤性生長，病程迅速進展，手術切除后常很快復發。惡性腫瘤病人治療失敗和致死的主要原因就是腫瘤的侵襲和轉移[3]。在已知的惡性腫瘤中，除皮膚基底細胞癌、某些中樞神經系統腫瘤極少發生轉移外，其他絕大多數腫瘤在疾病的進展過程中都可以發生轉移。而腫瘤的侵襲和轉移是一個多階段的過程，包括腫瘤細胞與細胞外基質(ECM)成分特異性粘附、降解ECM以及降解區域趨化因子的釋放等。其中，腫瘤細胞侵襲和轉移的一個必需步驟就是穿越基底膜侵入周圍基質。許多研究發現，該過程常伴隨著MMP-9表達與活性的增高，這為臨床給予早期干預措施提供了重要依據[4]。

本實驗從探索EGCG對U87MG細胞MMP-9酶活性的影響入手，研究表明EGCG能抑制PMA誘導的RU87MG細胞MMP-9的活性，且隨著EGCG濃度的增加，U87MG細胞MMP-9的酶活性減弱越明顯。并從基因轉錄及蛋白表達水平研究了其可能的機制，研究表明EGCG可以從基因及蛋白水平抑制MMP-9的酶活性，說明EGCG是一種潛在的MMP-9酶抑制劑。GBM的轉移、擴散常意味著預后差[6]。了解其轉移、擴散的分子機制，采取相應的靶治療對控制癌細胞的轉移，提高晚期患者的生存率有重要的意義。本研究表明EGCG能明顯降低MMP-9基因的表達水平和活性，從而發揮其抗腫瘤活性，然而具體的調控機制還有待我們進一步研究。

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[3]Rolle CE, Sengupta S, Lesniak MS.Challenges in clinical design of immunotherapy trials for malignant glioma[J].Neurosurg Clin N Am，2010;21(1):201-214.

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[5]師怡,林建銀.基質金屬蛋白酶抑制劑與腫瘤的相關性研究新進展[J].當代醫學,2009,15(18):27-28.

[6]Van Gool S, Maes W, Ardon H, et al.Dendritic cell therapy of high-grade gliomas[J].Brain Pathol, 2009,19(4):694-712.