人剪切修復基因XPD對p52和p21基因的影響*

馬果果 張吉翔

腫瘤屬于基因疾病，其生物學基礎是基因的異常。DNA損傷若不能得到及時有效地修復，積累到一定程度可導致基因組不穩定性升高，從而引起細胞增殖和分化失控，導致腫瘤的發生[1]。XPD是哺乳動物基本轉錄因子ⅡH（TFⅡH）的核心亞單位之一，參與基因轉錄、核苷酸切除修復及細胞周期調控，并影響多種抑癌基因和癌基因的表達[2]。XPD過表達對腫瘤生長的影響已成為近年來研究的熱點。本研究將野生型XPD基因轉染入人肝癌細胞HepG2中，并檢測XPD、p52及p21的表達，觀察轉染前后肝癌細胞的生物學變化。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞HepG2購自美國模式菌種收集中心。重組質粒pEGFP-N2-XPD（XPD質粒）及胎中血清Fetal Bovin Serum（pEGFP-N2，N2質粒）由本實驗室構建[3]。MEM培養基購自美國Gibco公司。胎牛血清（FBS）購自澳大利亞Hy?clone公司。Lipofectamine 2000TM、Trizol購自美國Invitrogen公司。M-MLV Reverse Transcriptase、Rnasin、dNTP、Oligo（dT）及N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）購自美國Promega公司。PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。Tag PCR Master?Mix、Markr I購自北京天根生化科技有限公司。總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。單克隆抗體XPD、p52、p21購自美國Santa Cruz公司。異丙醇、氯仿、無水乙醇購自上海振華化工廠。DMSO（Dimethyl sulfide）、DEPC（Diethyl pyrocarbonate）購自美國Ameresco公司。Tris購自美國Roche公司。MTT購自上海普飛生物技術有限公司。

1.2 細胞培養及轉染 HepG2細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2孵箱中培養，以0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次。根據細胞處理情況的不同分為3組：肝癌細胞無轉染空白對照組HepG2、空載質粒轉染細胞HepG2-pEGFP-N2組（N2組）以及重組質粒轉染細胞HepG2-pEGFP-N2-XPD組（XPD組）。以2×105/孔的密度鋪于6孔板內，24 h細胞鋪滿50%～80%，用脂質體2000進行瞬時轉染。Trizol法提取細胞總RNA，合成cDNA。PCR擴增XPD、p52以及p21。根據GenBank上公布的人類XPD、p52及p21 mRNA序列，應用Primer Primier 5軟件設計引物，由上海生工生物工程公司合成，見表1。同一標本擴增β-actin作為內參照。PCR通過94℃預變性5 min，94℃45 s，54℃60 s，72℃45 s，35個循環后72℃終末延伸10 min。PCR產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳（含5 mg/L溴化乙錠）后，在紫外燈下觀察結果。通過Quantity One圖像分析軟件（Bio-Rad公司）讀取目的電泳條帶的斑點密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組的XPD、p52及p21的密度掃描值，獲得其mRNA相對表達量。

表1 XPD、p52及p21引物序列

1.3 Western blot檢測 使用蛋白抽提液分別提取3組細胞的總蛋白，全自動生化分析儀（Beckman，USA）測定蛋白濃度。取同量蛋白上樣于8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，繼而轉移蛋白于硝酸纖維素膜；將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中4℃封閉過夜，加封閉液稀釋的一抗（1∶200）過夜，用TBST洗膜3次，15 min/次，加封閉液稀釋HRP標記二抗（1∶2 000），4℃過夜，TBST洗膜3次，30 min/次，最后ECL顯色，經曝光、顯影、定影后，觀察結果。通過Quantity One圖像分析軟件（Bio-Rad公司）讀取目的電泳條帶的斑點密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組的XPD、p52、以及p21的密度掃描值，獲得其蛋白相對表達量。

1.4 MTT法檢測細胞增殖力 上述3組細胞于對數期分別接種于96孔板中，每孔1×103個細胞，以培養基為對照組，于37℃、5%CO2的條件下培養24 h后每孔加入5 g/L MTT 10 μL，繼續培養4 h，棄上清，加入100 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀測定492 nm處各孔光密度（OD）值，取每孔平均值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件進行分析，符合正態分布的計量資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pEGFP-N2-XPD轉染結果 通過脂質體轉染方式將pEGFP-N2和pEGFP-N2-XPD重組質粒轉染入HepG2細胞40 h后，熒光顯微鏡下可見XPD組和N2組細胞中均有綠色熒光蛋白的表達，未轉染的HepG2細胞則未見表達，見圖1。

2.2 各組細胞內XPD、p52及p21 mRNAs表達量情況 XPD組中XPD mRNA、p21 mRNA表達量高于相應N2組和空白對照組，而p52 mRNA表達量低于N2組和空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2、圖2。

表2 各組細胞XPD、p52、p21 mRNA的表達比較（±s）

表2 各組細胞XPD、p52、p21 mRNA的表達比較（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表3同

組別XPD組（1）N2組（2）空白對照組（3）F q（1）∶（2）（1）∶（3）n666 XPD 0.984±0.005 0.339±0.004 0.298±0.010 9 288.947＊＊2.474＊1.723＊p52 0.213±0.007 0.617±0.007 0.596±0.066 104.335＊＊1.311＊1.766＊p21 0.862±0.005 0.197±0.012 0.205±0.011 4 605.148＊＊5.383＊＊5.893＊＊

2.3 各組細胞XPD、p52及p21蛋白的表達情況比較 XPD組中XPD、p21蛋白表達量高于N2組和空白對照組，而p52低于其他2組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表3、圖3。

表3 各組細胞XPD、p52、p21蛋白的表達情況（±s）

表3 各組細胞XPD、p52、p21蛋白的表達情況（±s）

組別XPD組（1）N2組（2）空白對照組（3）F q（1）∶（2）（1）∶（3）n666 XPD 0.913±0.014 0.284±0.021 0.267±0.023 174.683＊＊1.729＊1.479＊p52 0.211±0.009 0.589±0.007 0.607±0.008 236.551＊＊1.761＊1.320＊p21 0.892±0.009 0.273±0.009 0.255±0.011 418.692＊＊2.986＊2.506＊

2.4 pEGFP-N2-XPD重組質粒對HepG2細胞增殖活力的影響 XPD組、N2組、空白對照組的OD值分別為0.475±0.010、0.927±0.016、0.934±0.010，3組比較差異有統計學意義（F=1 213.506，P＜0.01）。XPD組與其他2組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

3 討論

TFⅡH是一個多酶復合物，通過XPD的橋梁作用把核心亞復合物（由XPB、p62、p52、p44、p34及p8組成）和CAK亞復合物（由cdk7、cyclin H和MAT1組成）聯系起來。XPD作為TFⅡH的支架，在核苷酸切除修復過程中負責從5→3方向打開受損位置的DNA雙鏈。XPD基因發生突變時，核苷酸剪切修復受到影響，發生腫瘤的概率更高。最近研究發現，XPD及環境因素共同作用，與肝癌的發生有密切關系[4]。

目前國內外對XPD基因與p52基因間的關系研究報道尚少。p52又稱核因子（NF）-kappa B2，活化的NF-kappa B復合物是Rel多肽家族不同形式二聚體的組合，包括p50（NF-kappa B1）、p52（NF-kappa B2）、CRel、VRel、Rel（ALPG）和RelB。NF-kappa B信號傳導通路在不同腫瘤的演進和發展過程中均起著關鍵的作用[5]。Ras具有誘導細胞調亡的作用，而NF-kap?pa B可以抑制這一作用，從而促進腫瘤生長[6]。在大部分肝癌中都有Bcl-3的異常表達，Bcl-3與NF-kappaB p50和p52相互作用，Bcl-3/p50或者Bcl-3/p52的相互作用對肝癌的發生有重要影響[7]。已有研究表明，XPD基因可激活p53[8]，而p53可以選擇性下調Bcl-3蛋白水平,抑制cyclin D1啟動子活性，降低cyclin D1蛋白和mRNA的表達水平，進而導致細胞在G1期阻滯，抑制細胞增殖。本研究結果顯示，將XPD轉染入HepG2肝癌細胞后，p52在mRNA和蛋白水平的表達量均有明顯下降，表明XPD對p52基因的表達可能有抑制作用，從而起到了抑制癌細胞生長的作用。

p21又稱細胞周期調控基因，可以通過2條途徑發揮作用，一是p53介導的途徑，p21WAFl/C1P1基因是p53基因最重要的下游特異性基因之一，當細胞受到來自體外或體內的各種損傷后，野生型p53蛋白作用于p21基因，使其迅速表達，從而發揮p21生物學功能。二是非p53依賴途徑，近年研究發現，在腫瘤壞死因子、組織型纖溶酶原激活劑等因素的作用下，p21基因可以脫離p53的作用快速發生反應，使受損的細胞發生G1、G2期的細胞周期阻滯[9]。p21作為細胞周期負性調節因子，p21蛋白表達減弱，可導致細胞增殖失去有效監控及瘤細胞惡性表型增加，從而參與腫瘤的形成和發展。本研究顯示轉染XPD后，p21的表達量上調，肝癌細胞生長受到抑制，進一步證實了p21基因發揮的抑癌作用。

野生型p53是公認的抑癌基因。研究表明，XPD基因可激活p53，并且影響其生物活性[8]，而p21是p53的下游激活產物，XPD可以通過p53間接上調p21。另一方面，p52又能抑制細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑p21的表達[10]。所以筆者推測轉染后p52表達量的降低可能導致對p21抑制作用減弱，p21表達量增加。

綜上，XPD可與p21協同作用對肝癌細胞的生長產生抑制，XPD通過抑制促癌基因p52表達，降低HepG2肝癌細胞的增殖能力。所以，XPD基因的轉染可通過對相關基因的影響有效地抑制HepG2細胞的生長，可為臨床治療肝癌提供新的思路。

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