電針對嗎啡耐受大鼠辣椒素受體磷酸化水平變化的影響*

黃美娜 鄭宇欣 于泳浩 王國林

慢性疼痛是臨床常見合并癥，阿片類藥物是用于治療急慢性疼痛的重要藥物，除已知的不良反應外，長期應用還會導致阿片耐受和耐受相關痛覺過敏，限制了阿片類藥物的臨床應用。因此，阿片耐受的細胞核分子機制及臨床干預手段成為近年來研究的熱點。有研究表明辣椒素受體成員-瞬時受體電位辣椒素亞家族成員1（transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1）在嗎啡耐受和耐受相關熱痛覺過敏的形成中起著重要作用[1]。針刺鎮痛是傳統醫學的瑰寶，臨床實踐證實電針是一種有效的鎮痛手段。而對電針鎮痛機制的研究已有很多，腦干下行抑制系統、阿片系統、交感神經系統均可能參與了電針鎮痛過程[2-3]，但辣椒素受體的磷酸化過程是否參與了電針鎮痛過程尚未明確。本文研究電針對慢性嗎啡耐受大鼠行為學的影響及背根神經節內磷酸化TRPV1在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，10～12周齡，體質量250～280 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，安靜環境中飼養，自由攝食飲水，保持晝夜節律。熱板、足底觸覺測試器（意大利UGO BASILE公司），電針刺激儀LH202N（北京韓氏電針儀器廠）；兔抗大鼠P-TRPV1單克隆抗體（日本COSMO BIO公司）；HRP標記的羊抗兔抗體IgG（美國Cell Signaling公司）；RIPA裂解緩沖液I（上海生工生物工程技術服務有限公司產品）；電化學發光溶液（美國Millipore公司）。

1.2 動物模型建立 參照Yaksh等[4]的方法進行鞘內置管，置管24 h后，對未出現神經系統癥狀的大鼠經導管注入2%利多卡因20 μL，如出現雙側后肢麻痹，則證明導管位于蛛網膜下腔。將大鼠隨機分為3組，每組8只，于大鼠右后肢踝關節腔內注入完全氟式佐劑（CFA）50 μL，建立CFA模型。模型建立后第4天，開始鞘內給藥。N組鞘內給予生理鹽水10 μL；M組鞘內給予嗎啡10 μg（10 μL）；H組除每天鞘內給予10 μg嗎啡外，于每天首次給藥后電針刺激大鼠足三里和陽陵泉兩穴，電流強度≤2 mA，頻率2 Hz，時間30 min；給藥時間為每天早8：00和晚8：00各1次。給藥7 d，第8天將大鼠處死，取致炎側L4～5背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）進行分析。

1.3 機械痛閾值測定 每天9：00在室溫（20±2）℃的安靜環境中測定，用Von Frey絲參照up-and-down方法測定大鼠患足50%機械縮爪閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）[5]。

1.4 熱痛閾值的測定 用熱板儀（50℃）測定大鼠致炎后肢縮腳潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）。進行測試前所有大鼠進行把持訓練，開始試驗后在室溫（20±2）℃的安靜環境中測試，每10 min測定1次，取3次測定數值的平均值作為測定結果。為防止大鼠燙傷，將PWL上限值定為30 s。

1.5 背根神經節內磷酸化TRPV1（P-TRPV1）表達的West?ern blotting測定及分析 于給藥第8天將大鼠用水合氯醛麻醉，小心剪開胸腔，暴露心臟。剪開右心室，同時經左心室灌注生理鹽水，以減少標本上紅細胞的殘留及測定蛋白濃度時的誤差。大鼠處死后，立即暴露脊髓，取出致炎側L4～5DRG，冰上操作（并保持無菌），迅速放入液氮保存。將背根神經節放入液氮預冷的研缽中研碎，加入按比例配好的（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）RIPA裂解緩沖液。在裂解液中充分勻漿（始終在冰浴中進行）。取勻漿4℃靜置30 min，低溫高速離心，12 000×g，10 min重復2次，取上清液測定蛋白濃度。蛋白用100℃變性10 min，每個電泳道中放入30 μg總蛋白（約20 μL），采用8%SDS-PAGE凝膠分離蛋白，轉膜。濾膜在室溫下于含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉2 h后，一抗4℃孵育過夜。所得的印跡再在室溫下與辣根過氧化物酶（HRP）結合的二抗孵育1 h，在電化學發光溶液中顯影30 s～1 min，暴露于X線片上。采用UMAX PowerLook 2100XL掃描圖像，并用Quantity One（美國Bio-Rad公司）軟件對Western blotting條帶進行灰度分析，記錄其灰度值。蛋白質相對含量的表述方式：TRPV1總蛋白與β-actin條帶光密度的比值表示總蛋白的表達情況，P-TRPV1與TRPV1總蛋白條帶光密度的比值表示P-TRPV1的表達情況，按計量資料進行統計分析。

1.6 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件分析數據，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，組內比較采用重復測量資料方差分析，各組間實驗結果比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗或q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學測定 與置管后相比，致炎后N組、M組、H組大鼠痛閾均明顯降低（MWT、PWL均P＜0.01）。N組在給予生理鹽水的7 d中痛閾變化不明顯（MWT③∶④、③∶⑤、③∶⑥、④∶⑤、④∶⑥、⑤∶⑥P分別為0.546、0.530、0.536、0.247、0.167、0.263；PWL③∶④、③∶⑤、③∶⑥、④∶⑤、④∶⑥、⑤∶⑥P分別為0.323、0.061、0.058、0.057、0.222、0.601），M、H組大鼠在給予嗎啡后第1天MWT和PWL與N組相比均升高（P＜0.01）；H組在給藥第7天MWT和PWL與M組相比升高（P＜0.01）；M組于給藥后第5天MWT和PWL開始較給藥第3天減低（P＜0.01），以后繼續減低，給藥第7天MWT和PWL仍處于較低水平，見表1～3。

2.2 TRPV1總蛋白及磷酸化蛋白的表達 TRPV1總蛋白：3組間比較F=31.454，P＜0.05，M組表達明顯高于N組和H組，N組與H組比較差異無統計學意義，見圖1、2。P-TRPV1 3組間比較F=190.877，P＜0.05，M組P-TRPV1表達明顯多于N組和H組，差異有統計學意義，但N組與H組相比差異無統計學意義，見圖1、3。

3 討論

以往的研究多用單純嗎啡耐受動物模型研究慢性嗎啡耐受機制，這種模型缺少疼痛損傷，與臨床狀況不完全一致。因此筆者以CFA誘導的關節炎大鼠模型為基礎，通過持續鞘內給予嗎啡，在嗎啡治療炎性痛的背景下形成嗎啡耐受模型，并以此為基礎研究電針在嗎啡耐受形成過程中的作用。本研究行為學結果顯示，關節炎大鼠鞘內反復注射嗎啡（M組），在給藥第5天，大鼠熱痛閾和機械痛閾均明顯降低，第7天仍處于較低水平，提示形成了熱痛覺過敏，標志炎性痛慢性嗎啡耐受模型建立成功。

表1 各組大鼠MWT比較 （n=8，±s）

表1 各組大鼠MWT比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F組間=192.202，F組內=341.361，F交互=51.44，均P＜0.001

組別 致炎后3 d②置管后① 給藥N組M組H組F q N∶M N∶H M∶H 21.23±1.90 21.05±2.30 20.78±2.46 0.035 6.72±0.46 6.67±0.59 6.47±0.62 0.26 ------第1天③6.67±0.26 16.86±1.98 20.78±2.46 58.616＊＊15.21＊＊21.06＊＊5.85＊＊第3天④6.90±0.38 15.97±2.06 17.81±1.38 82.029＊＊19.01＊＊22.87＊＊3.85＊組別 給藥F N組M組H組F q N∶M N∶H M∶H第5天⑤6.55±0.37 8.57±0.75 15.49±1.99 28.967＊＊4.23＊20.84＊＊16.13＊＊第7天⑥6.95±0.37 6.38±0.64 13.10±0.97 33.054＊＊2.20 23.74＊＊25.94＊＊417.015＊＊150.69＊＊80.14＊＊----

表2 各組大鼠PWL比較 （n=8，±s）

表2 各組大鼠PWL比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F組間=81.196，F組內=564.246，F交互= 69.446，均P＜0.001

給藥組別 置管后① 致炎后3 d②N組M組H組F q N∶M N∶H M∶H 17.10±0.67 17.31±0.77 16.82±0.89 0.38 10.58±0.61 11.33±0.88 10.73±0.82 0.46 ------第1天③9.40±0.81 14.56±0.88 15.43±0.75 50.09＊＊15.03＊＊17.58＊＊3.76＊第3天④8.75±0.86 13.83±0.75 14.14±0.91 62.09＊＊15.97＊＊17.84＊＊1.03組別 給藥F N組M組H組F q N∶M N∶H M∶H第5天⑤7.64±0.61 8.57±0.86 12.84±0.94 57.80＊＊2.28 23.74＊＊19.49＊＊第7天⑥7.85±0.53 7.11±0.80 11.56±0.87 35.23＊＊3.03 15.21＊＊18.24＊＊308.305＊＊213.689＊＊173.897＊＊----

表3 嗎啡耐受組（M組）各指標組內比較P值

圖1 各組DRG內P-TRPV1和TRPV1總蛋白Western blotting結果

圖2 TRPV1總蛋白灰度值

圖3 P-TRPV1灰度值

TRPV1是一種非選擇性陽離子通道，廣泛分布于神經系統，它在炎性痛、熱痛覺過敏、機械性痛覺異常、神經病理痛的形成過程中起著重要作用。像許多離子通道一樣，TRPV1通道的功能能被磷酸化/去磷酸化過程所調節，TRPV1存在著以Ser502和Ser800為主的若干蛋白激酶C（PKC）磷酸化位點，PKC通過這些位點實現對TRPV1的磷酸化過程[6]。Premkumar等[7]發現PKC能夠在缺乏其他激動劑的條件下單獨誘導激活TRPV1，同時能增強TRPV1對辣椒素的反應，提示PKC能促進TRPV1活化并增強其功能。CFA所致炎癥情況下，感覺神經纖維末梢釋放谷氨酸（Glu）、P物質（SP）等興奮性氨基酸及神經多肽，激活相應興奮性氨基酸和神經激肽受體，導致神經元細胞產生第二信使。離子型興奮性氨基酸受體（NMDA）活化后，刺激Ca2+內流從而激活PKC，進而磷酸化TRPV1參與炎性痛的形成，這也解釋了為什么實驗中N組大鼠在單純炎癥情況下會存在磷酸化形式的TRPV1。

本實驗中TRPV1總蛋白水平M組＞H組＞N組，與Chen等[1]的研究結果不一致。在Chen等的研究中，嗎啡耐受組大鼠DRG中TRPV1表達量用Western blotting方法檢測與非嗎啡耐受組無明顯差別，而免疫組化結果示嗎啡組TRPV1表達增高，其原因在于Western blotting為半定量檢測手段，敏感性低，不能顯示細微差別。但其研究基于單純嗎啡耐受模型，沒有慢性炎癥的基礎，因此筆者認為，本研究中嗎啡組TRPV1總蛋白增高的原因，在于模型具有慢性炎癥和嗎啡耐受共同參與的復雜性。然而從磷酸化TRPV1占TRPV1的百分比來看，嗎啡組TRPV1磷酸化水平仍然高于其他2組，說明嗎啡耐受情況下，TRPV1磷酸化水平增高。

嗎啡是臨床常用的鎮痛藥物，但長期應用會導致耐受和耐受相關熱痛覺過敏。嗎啡耐受的機制尚未完全清楚，但研究發現蛋白激酶途徑在嗎啡耐受過程中同樣起著重要作用[8-9]。研究表明，通過RNA干擾技術干擾PKCγ基因表達可以逆轉慢性嗎啡耐受的形成[10]。本研究結果顯示，M組背根神經節內TRPV1磷酸化水平明顯增高，進一步證明，長期嗎啡給藥導致了激酶活性增加，從而增加了TRPV1的磷酸化水平，同時此結果也可解釋行為學結果中M組在給藥第5天至第7天熱痛閾值較前明顯降低的原因，即熱痛覺過敏形成的原因在于DRG內TRPV1的磷酸化水平增加，說明TRPV1磷酸化過程在嗎啡耐受的形成中起了重要作用。

針刺鎮痛是我國傳統醫學的瑰寶，療效已得到國內外研究者的肯定。在此基礎上發展起來的電針療法，在臨床治療中也取得了顯著的成果。有研究表明，電針鎮痛有著穴位特異性，雙側足三里電針刺激可明顯延長縮爪時間，而手三里和內關穴則無此效果[11]。因此本研究選擇大鼠雙側足三里和陽陵泉作為電針鎮痛的穴位。與形成嗎啡耐受的M組大鼠相比，給藥第7天H組大鼠MWT和PWL升高，提示H組大鼠尚未形成嗎啡耐受，說明電針對嗎啡耐受的形成具有緩解作用。H組DRG內磷酸化TRPV1表達少于M組，筆者可認為電針刺激通過抑制TRPV1的磷酸化而緩解嗎啡耐受的形成。

綜上所述，本研究以CFA誘導的炎癥大鼠模型為基礎，通過持續鞘內給藥建立慢性嗎啡耐受模型，并證明嗎啡耐受情況下大鼠背根神經節內TRPV1磷酸化水平增加，而電針能抑制TRPV1的磷酸化，從而緩解嗎啡耐受的形成，但電針是通過怎樣的機制抑制TRPV1的磷酸化，仍有待進一步研究。

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