大劑量放療后豚鼠內耳螺旋神經節細胞Caspase 3的表達*

謝利紅 唐安洲 尹時華 譚頌華

放射治療是頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段。在放射治療中，患者的內耳、聽神經和部分腦干均包括在照射野內[1]。60Co輻射導致感音神經性耳聾為其常見的并發癥，嚴重影響患者的生存質量。Caspase 3是近年來發現的類半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，是細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，單獨或協同參與水解與凋亡有關的蛋白質[2]。本文旨在研究Caspase 3在螺旋神經節細胞（SGC）中的表達，對放療后螺旋神經節細胞（SGC）的損傷情況進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 白化豚鼠40只，體質量250～350 g，普通級，購自湖南省長沙市開福區東創實驗動物科技服務部，雌雄不拘。豚鼠自由飲水進食，室溫23～26℃。全部實驗動物用電耳鏡檢查無中耳感染，耳廓反應靈敏。隨機分為5組，每組8只，右耳為放射組，左耳為對照組。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 豚鼠用1%戊巴比妥鈉（3.5 μL/g）麻醉固定后，用GWXJ80型60Co遠距離治療機對豚鼠右耳顳部做一次性60Co照射70 Gy，輻射深度2.0 cm，照射范圍為2 cm×2 cm，源皮距80 cm，自制鉛板遮蓋非照射部位。

1.2.2 石蠟標本制備 實驗動物于放療后1、4、7、14和30 d用1%戊巴比妥鈉（3.5 μL/g）麻醉后處死，經腹側取聽泡，暴露耳蝸并在蝸尖鉆孔，推鐙骨底板脫位，刺破圓窗膜，用4%多聚甲醛固定液灌流固定后，再放入固定液4℃固定24 h以上。用10%EDTA脫鈣10～14 d，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，耳蝸中軸切片。

1.2.3 HE染色 石蠟切片脫蠟和水化，蘇木精染液染色10 min，1%鹽酸乙醇分色，流水沖洗后，自來水藍化10 min，0.5%伊紅染液染色1 min，依次經70%、85%、95%和100%乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

1.2.4 免疫組織化學 石蠟切片脫蠟和水化，pH 6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液煮沸熱修復抗原10 min，3%H2O2室溫孵育15 min，非免疫血清封閉10 min，加Caspase 3一抗（1∶500）4℃6 h，加二抗，室溫下孵育10～15 min，加三抗室溫下孵育10～15 min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。陰性對照染色切片用PBS代替一抗，其他實驗步驟不變。Cas?pase 3的陽性表達為細胞漿呈棕黃色染色。通過IPP6圖像分析軟件計算其光密度（OD）值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SGC的HE染色 對照組豚鼠SGC結構正常，見圖1，而放療組的SGC在放療后不同時間點出現SGC的萎縮，表現為細胞漿的減少、細胞核濃縮凝集、缺失或者整個細胞的缺失，見圖2。放療后各不同時間點SGC萎縮率與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），并且隨著放療后時間的延長，上述變化更明顯，見表1。

2.2 SGC的免疫組化染色 放療組SGC的Caspase 3陽性表達較對照組增強，見圖3～5。放療后不同時間點SGC的Caspase 3 OD值與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 SGC萎縮細胞率及Caspase 3的OD值（n=8，±s）

表1 SGC萎縮細胞率及Caspase 3的OD值（n=8，±s）

t為放療各組與對照組比較；＊＊P＜0.01

組別對照組放療組1 d 4 d 7 d 14 d 30 d F SGC萎縮（%）0 22.68±2.45 26.32±1.28 27.26±1.02 32.76±1.25 49.20±6.07 155.54＊＊t-t-12.78＊＊14.84＊＊15.36＊＊18.46＊＊27.73＊＊Caspase 3（OD值）16.38±3.39 45.83±7.20 44.89±5.22 143.68±9.07 28.55±1.29 42.35±5.07 249.13＊＊7.21＊＊6.98＊＊31.17＊＊2.98＊＊6.36＊＊

3 討論

有學者通過觀察放療后內耳螺旋器（Corti器）和血管紋的損傷發現，放療后內耳細胞的損傷呈劑量相關性[3]。放療對Corti器，外毛細胞損傷比內毛細胞更嚴重。也有學者發現，一次性使用50 Gy劑量對豚鼠耳蝸進行輻射，明顯地產生了聽覺障礙，光鏡及電鏡觀察中均發現輻射對于耳蝸基底膜內毛細胞的破壞要比外毛細胞更為嚴重，并出現神經末梢及突觸的損害，并認為這種聽功能的損害不僅與內毛細胞的損害有關，還與神經及突觸的破壞有關[4]。

Enver等[5]研究發現給予耳顳部33 Gy的放療總劑量后數小時即可出現耳蝸細胞的損傷，表現為螺旋神經節細胞萎縮或消失，毛細胞缺失，血管紋的萎縮等表現。本研究中也發現一次性給予70 Gy的射線照射后，出現明顯的耳蝸螺旋神經節細胞的損害表現。動物實驗證明，在非放療（如噪聲、藥物等）引起的耳蝸細胞損傷中，活性氧起到重要作用，活性氧通過影響線粒體的滲透壓，促進細胞色素C的釋放，活化P53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，促進細胞凋亡[6]。Caspase 3正常情況下，以無催化活性的酶原形式存在于胞質內。當細胞進入凋亡過程時，則經由特異的Asp殘基處的蛋白水解作用而被激活，從而產生了蛋白水解作用，形成的Caspase自我放大級聯反應，進而裂解DNA損傷細胞。Cas?pase 3陽性表達意味著細胞凋亡在進行過程中。在本研究中，放療后1、4、7、14和30 d均可見SGC的細胞漿內有Caspase 3蛋白表達，表明Caspase 3的活性增高可能與放療后內耳螺旋神經節細胞的損傷有關，可能參與了放射治療誘導耳蝸細胞凋亡損傷的調控。

[1]Ondrey FG,Greig JR,Herscher L.Radiation dose to otologic struc?tures during head and neck cancer radiation therapy[J].Laryngo?scope,2000,110(2):217-221.

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[3]Kim CS,Shin SO.Ultrastructural changes in the cochlea of the guin?ea pig after fast neutron irradiation[J].Otolaryngol Head Neck Surg, 1994,110(4):419-427.

[4]王家東，丁大連，金西銘，等.一次性大劑量60鈷輻射對豚鼠耳蝸影響的實驗研究[J].聽力學及言語疾病雜志,1999,7(3):141-142.

[5]Enver A,Mustafa V,Ozan K,et al.Effects of piracetam supplementa?tion on cochlear damage occuring in guinea pigs exposed to irradia?tion[J].Biol Pharm Bull,2006,29(7):1460-1465.

[6]Low WK,Tan MG,Sun L,et al.Dose-dependant radiation-induced apop?tosis in a cochlear cell-line[J].Apoptosis,2006,11(12):2127-2136.