雷帕霉素對糖尿病腎病大鼠的保護作用

馮 欣 李 垚 王雪鷹

糖尿病腎病（DN）是糖尿病（DM）最常見的嚴重微血管并發癥，一旦腎臟受累出現持續性蛋白尿，往往不可逆轉，并在較短時間內進入終末期腎功能衰竭。因此，如何更有效地延緩或阻止DN的進展，具有重要的臨床意義。雷帕霉素（RAPA）是一種大環內酯類抗生素，也是安全、有效、低毒的新型免疫抑制劑。近年來動物實驗發現RAPA不僅有免疫抑制作用，而且能抑制血管平滑肌增生和移行，減輕纖維化反應[1]，但是對DN的作用機制及療效觀察尚少見報道。本實驗探討了RAPA對糖尿病大鼠腎臟早期病變的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年清潔級SD大鼠36只，體質量250～300 g，購自遼寧醫學院實驗動物中心。將36只大鼠用隨機數字表法分為對照組、糖尿病模型組（糖尿病組）、糖尿病雷帕霉素治療組（雷帕霉素組），每組12只。在造模成功后，雷帕霉素組每天予雷帕霉素1 mg/kg灌胃，對照組和糖尿病組每天予等量生理鹽水灌胃，飼養至4周后處死。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病動物模型的建立 擬造模大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），溶于0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH 4.5，65 mg/kg，對照組只注射相當體積的枸櫞酸鹽緩沖液，48 h后尾尖取血，血糖儀測定血糖，尿糖試紙測定尿糖，血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++～++++者確定為糖尿病模型。實驗期間動物自由進食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.2.2 實驗試劑 小鼠抗大鼠細胞增殖核抗原（PCNA）抗體（Santa Cruz公司）；小鼠抗大鼠Ⅳ型膠原（COL-Ⅳ）多克隆抗體（SantaCruz公司）；雷帕霉素口服液，1mg/mL（華北制藥集團）。

1.2.3 大鼠血、尿生化指標的測定 每個樣本取20 μL血清和20 μL尿液用日立7170A全自動生化分析儀測定血糖（Glu）、血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和尿蛋白（UPro）。

1.2.4 組織學檢查 腎組織常規脫水、透明、浸蠟、包埋。4 μm石蠟切片用于蘇木素伊紅（HE）、過碘酸雪夫（PAS）染色，光鏡下觀察。

1.2.5 PCNA、COL-Ⅳ蛋白的表達 采用Western blotting法。處死各組大鼠，冰上分離腎皮質，剪碎組織，放入80目不銹鋼篩網研磨，不斷用生理鹽水沖洗，然后經140目不銹鋼篩網過濾，再經200目不銹鋼篩網過濾，最后收集篩網上物質，冷鹽水清洗，4℃、2 000 r/min離心5 min，所得沉淀物經光鏡觀察確定95%以上為腎小球。RIPA裂解液裂解細胞，冰浴靜置1 h，然后4℃、14 000 r/min離心25 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度后，制成蛋白濃度相等的樣品。8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上垂直電泳（80 V，1 h）。電轉印至硝酸纖維素膜上（電壓60 V，3 h）。5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入PCNA、COL-Ⅳ抗體，孵育過夜，二抗室溫孵育2 h。用顯色液行堿性磷酸酶法顯色。Scinn Corporation分析軟件進行灰度值半定量分析。實驗重復3次。

1.3 統計學處理 用SPSS 11.0統計軟件分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，各組間進行組間單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的一般情況 與對照組相比，糖尿病組大鼠腹腔注射STZ 48 h后，表現為多食、多飲、多尿，毛色晦暗，逐漸出現消瘦及體質量減輕。尿糖+++～++++，血糖持續≥16.7 mmol/L，DM模型成立。給藥4周后，雷帕霉素組大鼠與糖尿病組相比，血糖無明顯減低，而腎質量/體質量顯著降低，見表1。

2.2 生化指標的變化 各組大鼠給藥4周后，糖尿病組大鼠與對照組相比BUN、Cr及UPro明顯增高（P＜0.05或P＜0.01），而雷帕霉素組上述指標較糖尿病組明顯減輕（均P＜0.05），見表1。

2.3 大鼠腎組織標本病理改變 光鏡下觀察，與對照組相比糖尿病組大鼠腎小球體積增大，系膜基質輕度增多，腎小管上皮細胞出現空泡變性，小灶狀萎縮，小動脈管壁輕度增厚，而雷帕霉素組上述改變明顯減輕，見圖1～3。

表1 各組大鼠生化指標和腎質量/體質量比較（n=12，±s）

表1 各組大鼠生化指標和腎質量/體質量比較（n=12，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組（1）糖尿病組（2）雷帕霉素組（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）Glu（mmol/L）4.12±1.43 28.71±2.38 25.82±2.15 34.77＊＊＜0.001＜0.001 0.413腎質量/體質量（×10-3）4.22±0.31 9.11±0.52 6.19±0.24 28.43＊0.035 0.046 0.023 BUN（mmol/L）5.24±0.74 14.34±1.85 8.26±0.82 62.56＊0.004 0.056 0.036 Cr（μmol/L）33.32±9.25 103.16±6.28 78.34±5.62 123.12＊＜0.001 0.035 0.019 UPro（g/24 h）6.33±1.84 15.63±2.32 7.31±1.54 50.65＊0.019 0.289 0.028

2.4 Western印跡結果 與對照組相比，糖尿病組大鼠腎小球PCNA和COL-Ⅳ蛋白表達水平均增高（P＜0.01）。與糖尿病組相比，雷帕霉素治療組大鼠腎小球PCNA和COL-Ⅳ蛋白表達明顯下調（P＜0.01），而雷帕霉素組與對照組比較，PCNA和COL-IV蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4、表2。

圖4 各組大鼠PCNA、COL-Ⅳ的蛋白表達

表2 各組大鼠PCNA、COL-Ⅳ的蛋白表達（n=3，±s）

表2 各組大鼠PCNA、COL-Ⅳ的蛋白表達（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組（1）糖尿病組（2）雷帕霉素組（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）PCNA 101.36±0.14 311.34±0.32 133.09±0.56 232.98＊＊＜0.001 0.067＜0.001 COL-Ⅳ223.67±0.17 381.21±0.34 260.68±0.32 487.45＊＊＜0.001 0.125＜0.001

3 討論

DN的發病機制復雜，遺傳背景、血流動力學改變、代謝紊亂、免疫因素均參與發病過程。越來越多的研究者認為磷脂酰肌醇3激酶（PI3-K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶（mammalian target of rapamycin，mTOR）途徑可能是影響DN病程的重要因素[2]。RAPA是從吸水性鏈霉菌發酵液中提取出來的一種低毒性大環內酯類抗生素[3]，具有抗自身免疫性疾病和抗細胞增殖、預防移植物血管病變的作用，臨床已用于血管支架涂層和器官移植術后，以減少排斥反應。RAPA進入細胞漿后，首先與FK結合蛋白（FK binding proteins，FKBP-12）結合，形成RAPA-FKBP復合體，該復合體通過與mTOR氨基酸殘基結合導致mTOR失活，阻礙其下游的信號轉導通路[4]。mTOR穩定狀態下主要存在于細胞胞質內，激活后進入胞核，調控下游靶分子真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白l（4E-BP1）和核糖體40S小亞基S6蛋白激酶，調控蛋白質的合成和細胞周期的演變，參與細胞因子和相應受體之間的作用及轉導跨膜信號。

RAPA有強大的抗炎、抗增殖、抗纖維化效應，在防治腎病中也發揮重要的作用。Lloberas等[5]研究發現糖尿病大鼠組織中磷酸化蛋白激酶B（P-AKT）和mTOR高表達，接受RAPA治療后，上述2個指標表達顯著降低，腎組織纖維連接蛋白水平和肌動蛋白表達也顯著下降，RAPA可以顯著抑制腎臟內mTOR通路下游基因表達，延緩糖尿病腎病的進展。另外，動物實驗證實RAPA能緩解膜性腎病中小管間質炎癥細胞浸潤和抑制纖維化進程；局灶節段性腎小球硬化病變早期給予RAPA治療能減弱腎小球硬化，緩解病情進展；RAPA可抑制腎切除后代償性的腎肥大及單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化進程[6]。RAPA在體外可抑制生長因子誘導的內皮細胞和平滑肌細胞增生，干擾細胞因子介導的信號傳導[7]。體外實驗證實低劑量RAPA可抑制系膜細胞增殖[8]。Pallet等[9]觀察到RAPA可以明顯抑制腎小管上皮細胞的增殖。

本研究結果顯示，光鏡下糖尿病組腎小球系膜基質增多，基底膜增厚，而雷帕霉素治療組上述病變大大減輕，說明RAPA可以抑制早期糖尿病腎小球的病變。細胞外基質的積聚是DN發生的主要原因，COL-Ⅳ是腎小管基底膜的主要成分，參與構成細胞外基質。本實驗也發現RAPA治療組腎臟COL-Ⅳ的表達較糖尿病組減少，說明RAPA可以減少糖尿病大鼠腎臟膠原的合成，進一步阻止細胞外基質的積聚，減少間質纖維化的發生。PCNA是一種細胞周期調節蛋白，其表達在G1期早期開始上升，S期達最高峰，G2期和M期持續下降，G0期維持在極低水平，因此可作為腎小管上皮細胞增殖的標志物。本研究顯示糖尿病組大鼠組織中高表達PC?NA，而經RAPA治療后PCNA表達顯著降低，可見予RAPA治療后腎小管上皮細胞的增殖明顯被抑制。

RAPA是一種療效好、低毒、無腎毒性的新型免疫抑制劑，本研究提示RAPA可以抑制糖尿病腎病大鼠的細胞增殖，減輕腎硬化，為臨床應用RAPA治療糖尿病腎病患者提供了實驗依據。

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