30份蓮種質資源的RAPD遺傳多樣性分析

吳景棟，劉生財，楊盛春，魏英輝，賴鐘雄，羅銀華，饒學雄，張銳，吳高杰

（1.福建建寧縣蓮籽科學研究所，354500；2.福建農林大學園藝植物生物工程研究所）

30份蓮種質資源的RAPD遺傳多樣性分析

吳景棟1，劉生財2，楊盛春1，魏英輝1，賴鐘雄2，羅銀華1，饒學雄1，張銳2，吳高杰2

（1.福建建寧縣蓮籽科學研究所，354500；2.福建農林大學園藝植物生物工程研究所）

采用RAPD分子標記技術對30份蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）種質資源的遺傳多樣性進行鑒定。篩選出14對有效引物進行PCR擴增，共產生2 146條帶，其中有1 516條為多態性條帶，各對引物的平均多態性條帶為108.29條，擴增條帶的多態率達70.64%。對所得到的30份蓮種質資源的RAPD圖譜進行組合和綜合分析，結果表明花蓮與子蓮的相似遺傳系數較高，說明這兩種蓮之間親緣關系比較近。

蓮；遺傳資源；RAPD；親緣關系

蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）是歷史悠久的古老植物，在長期的進化過程中，根據不同用途分化為子蓮、花蓮和藕蓮3個類型[1，2]。由于蓮是常異花授粉植物，不同品種間的基因交流易通過昆蟲的授粉來完成，這就造成蓮品種間遺傳資源的混合和品種內的遺傳變異較大，種質高度雜合[3，4]，采用分子生物學對其進行遺傳多樣性鑒定是十分必要的。

近幾年來，利用分子標記技術在分子水平上研究蓮的遺傳多樣性以及開展對蓮種質資源保護的研究成為熱點。RAPD分子標記技術具有簡單、高效、易操作等優點，同時，其在有效分析蓮的3大類型時是很有效的，還可以有效地發掘并利用蓮種質資源中的特異基因，加快對蓮種質資源的開發利用，提升蓮的價值[5]。本研究采用RAPD技術，對福建省建寧縣蓮籽科學研究所收集保存的30個蓮品種（系）進行了初步分析，研究品種（系）之間的遺傳關系，了解這些品種（系）間的親緣關系，為蓮的分類、遺傳圖譜的構建、DNA的指紋分析以及蓮的定向育種及種質資源保存等打下基礎[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為30個蓮資源的嫩葉（均由福建省建寧縣蓮籽科學研究所提供），品種名稱見表1。

1.2 試驗方法

①蓮基因組DNA的提取 參照陳義挺等[7]，孔德政等[8]，李煥苓等[9]的方法提取，提取物于-20℃下保存備用。

表1 蓮品種的編號和名稱

②基因組DNA的檢測 以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析DNA的完整性。取8 μL DNA上樣，凝膠電泳，把膠塊放到EB染色液中染色10 min，再用清水漂洗，放在凝膠成像儀下觀察、拍照并保存。

③PCR擴增體系及反應程序 采用25 μL反應體系，其中DNA模板1 μL（50 ng/μL），10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，隨機引物（10 mmol/L）l μL，Mg2+2.5 μL，無菌雙蒸水16.5 μL。

反應程序為：94℃預變性 3 min；94℃變性l min，38℃退火1 min，72℃延伸1 min，39個循環；72℃延伸10 min，于4℃下保存。PCR擴增反應結束后，采用l×TAE電泳緩沖液，于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色。用GelDoc-It凝膠成像系統觀察、拍照，記錄結果。

④RAPD反應引物的篩選 本試驗用形態差異較大、親緣關系較遠的蓮（舒月、冬荷）DNA為模板，對上海Sangon生物工程公司生產的200個RAPD引物中隨機挑選的48個隨機引物（10 bp的寡聚核苷酸）進行篩選。

⑤數據分析方法[10]a.條帶的記錄。根據同一引物在相同電泳遷移位置的有無統計譜帶，有帶的記為1，無帶的記為0，統計所有的二元數據，構建0，1矩陣。b.數據分析和處理方法。利用SPSS V13.0軟件對30份蓮資源進行聚類分析，建立遺傳關系聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 蓮基因組DNA的提取質量

30份蓮種質資源基因組總DNA經瓊脂糖電泳結果如圖1所示，基因組DNA電泳得到的條帶，比較整齊、清晰，分子量較大且基本無降解、斷裂，完整性好。另外，由圖1可見，DNA電泳后呈現一條遷移率很小的整齊條帶，但有少數彌散的熒光區出現，表明所提取的DNA樣品有少量的糖和RNA污染；從電泳圖譜中可知，所提DNA可以用于RAPD擴增。

圖1 蓮基因組總DNA瓊脂糖電泳圖譜

2.2 RAPD引物篩選

選擇多態性好、條帶清晰且穩定的14條引物作進一步分析。14條引物分別是：S107、S134、S158、S175、S70、S101、S102、S115、S142、S140、S160、S118、S138、S179（表2）。

表2 不同引物對30份蓮種質資源的PCR擴增位點分析

2.3 30份蓮的RAPD多態性分析

本研究選用14條引物對30份蓮DNA基因組進行RAPD-PCR擴增，獲得了不同基因組DNA擴增圖譜。從表2和擴增結果電泳圖（圖2）可以看出，14個隨機引物對30份蓮的擴增共產生2 146條清晰且重復性較好的條帶，不同引物獲得的擴增帶為59～226條，每個引物平均擴增條帶數為153.29條；其中有1 516條為多態性條帶，平均多態性條帶為108.29條，擴增條帶的多態率達70.64%。

圖2 部分引物的擴增結果

2.4 30份蓮RAPD的聚類分析

根據RAPD擴增結果，統計得到的譜帶，建立遺傳相似矩陣，利用SPSS V13.0軟件的Withingrouplinkage和Jaccard對30份蓮資源進行分析，獲得Jaccard相似系數表，結果如表3所示?；ㄉ徟c子蓮的相似遺傳系數比較高，這說明2種蓮之間的親緣關系比較近。

根據歐氏距離（ED）法計算各樣品間的遺傳距離，利用SPSS V13.0軟件的Within-grouplinkage和Jaccard對30份蓮資源進行分析，建立遺傳關系聚類樹狀圖（圖3），進一步揭示了30份蓮資源間的親緣關系。從聚類圖上明顯可以看出，當遺傳距離D= 15.00時，30份蓮種質分為3大組：第1組為3，4；第2組為5，16，17；其余25個品種為1組。當遺傳距離D=13.00時，可把30份建蓮種質分為5組：第1組為3，4；第2組，5（冬瓜蓮）單獨為1組；第3組為16，17；第4組為25，26，27，28，29，30；其余19個品種為第5組。當遺傳距離D=7.50時，30份蓮種質可分為14組。

表3 30份蓮種質資源分子標記的遺傳相似系數

3 結論與討論

RAPD分子標記技術具有簡單、高效、易操作等優點，但RAPD技術是由多種微量成分參加的生化反應，反應十分靈敏，反應體系及條件稍有變化，便會對其結果產生影響，因其影響因素較多，所以結果會出現重復性差等問題[9，11，12]。

圖3 30份建蓮資源的聚類分析

而RAPD技術在分析花蓮、子蓮、藕蓮時是很有效的[5]，因此本研究采用該技術對30份蓮種質資源進行鑒定分析是可行的。在研究中發現，子蓮和花蓮可以歸類為一個聚群，其原因可能是由于子蓮與花蓮之間的遺傳距離較近的原因。蓮是常異花授粉植物，不同品種間的基因交流很容易通過昆蟲的授粉來完成，這就造成品種間遺傳資源的混合和品種內的遺傳變異較大。本研究也發現，即使是同一地區的不同品種間也會有很大差別[13]。

RAPD技術的應用使在DNA分子水平上研究蓮資源遺傳多樣性成為可能，對分析蓮不同品種的系譜關系、親緣品種群間的系統發生關系及分類地位等方面都起著重要的作用。

[1]王其超，張行言，胡春根．荷花品種分類新系統[J]．武漢植物學研究，1997，15（1）：19-26．

[2]王蕓，劉玉平，劉義滿，等．分子標記技術在蓮遺傳多樣性分析中的應用[J]．長江蔬菜，2009（16）：8-10．

[3]薛建華，卓麗環，周世良．黑龍江野生蓮遺傳多樣性及其地理式樣[J]．科學通報，2006，51（3）：299-308．

[4]魏英輝，黃新忠，羅銀華，等．子蓮新品種——建選17號親本分子鑒定[J]．江西農業學報，2007，19（2）：43-45．

[5]郭宏波，李雙梅，柯衛東．花蓮種質資源的遺傳多樣性及品種間親緣關系的探討[J]．武漢植物學研究，2005，23（5）：417-421．

[6]鄭寶東，鄭金貴，曾紹校．中國蓮子種質資源遺傳多樣性的RAPD分析[J]．中國食品學報，2006，6（1）：138-143．

[7]陳義挺，賴鐘雄，陳菁瑛，等．65份枇杷種質資源的RAPD分析[J]．熱帶作物學報，2007，28（1）：65-71．

[8]孔德政，劉藝平，田云芳．改良CTAB法對碗蓮葉片基因組DNA提純效果的影響[J]．沈陽農業大學學報，2005，36（4）：428-431．

[9]李煥苓，賴鐘雄，陳義挺，等．66份荔枝古樹遺傳多樣性的RAPD分析[J]．熱帶作物學報，2009，30（4）：450-455．

[10]董艷．福建尤溪金柑RAPD分析及柑桔類種質資源的離體保存研究[D]．福州：福建農林大學，2010．

[11]蔡英卿，賴鐘雄，陳義挺，等．福建余甘子遺傳資源的RAPD分析[J]．熱帶作物學報，2007，28（2）：74-79．

[12]王玲，鄭金貴，賴鐘雄，等．辣椒遺傳多樣性的RAPD分析[J]．福建農林大學學報：自然科學版，2003，32（2）：213-216．

[13]郭宏波，柯衛東，李雙梅，等．野生蓮資源的RAPD分析[J]．植物學通報，2005，22（增刊）：64-67．

Analysis on Genetic Diversity of 30 Lotus(Nelumbo nuciferaGaertn.) Germplasm Resources by RAPD Maker

WU Jingdong1,LIU Shengcai2,YANG Shengchun1,LAI Zhongxiong2,WEI Yinghui1,LUO Yinhua1, RAO Xuexiong1,ZHANG Rui2,WU Gaojie2
(1.Research Institute of Seed Lotus,Jianning County,Fujian 354500; 2.Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University)

Genetic diversity of 30 lotus germeplasms was analyzed by RAPD marker.14 pair primers were adopted to analyze polymorphism in RAPD amplification,with 2 146 RAPD bands obtained.1 516 were polymorphic bands,with average polymorphic bands of 108.29 per pair of primers,covering 70.64%of the total bands.The RAPD map of 30 lotus germplasm resources was combined and comprehensively analyzed.The results showed that the genetic similarity coefficient between flower lotus and seed lotus was relatively high,indicating their close genetic relationship.

Lotus;Germplasm resources;RAPD;Genetic relations

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.017

國家公益性行業（農業）科研專項經費資助

吳景棟（1972-），男，高級農藝師，研究方向為子蓮育種和栽培，電話：0598-3960965，E-mail：wjd3960965@126.com

賴鐘雄（1966-），男，通信作者，博士，博士生導師，研究員，研究方向為園藝植物生物技術與遺傳資源，電話：0591-83789484，E-mail：Laizx01@163.com

2011-07-15