湖北及山東地區栽培芋病毒病的田間調查及其病原的分子檢測

施世明，洪霓

（華中農業大學植物科學技術學院，湖北武漢，430070）

湖北及山東地區栽培芋病毒病的田間調查及其病原的分子檢測

施世明，洪霓

（華中農業大學植物科學技術學院，湖北武漢，430070）

對湖北及山東地區種植的芋調查發現，田間芋病毒病發生普遍，癥狀表現主要有花葉、羽狀斑駁、畸形皺縮、褪綠斑點等。2010年9月30日對武漢蔬菜科學研究所國家種質武漢水生蔬菜資源圃種植的芋進行調查發現，以上4種癥狀的田間顯癥率分別為26.92%，16.67%，28.21%和3.85%，田間調查時未發現蚜蟲等媒介昆蟲。對不同來源的芋葉片樣品進行芋花葉病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）的RT-PCR檢測，各癥狀田間檢出率為21.1%～42.9%。

芋；病毒病；芋花葉病毒；田間調查；分子檢測

芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]又名芋頭、芋艿、毛芋等，為天南星科（Araceae）芋屬（Colocasia）多年生宿根草本植物，原產于中國、印度和馬來半島等熱帶沼澤地區，現已在世界各國廣泛種植。芋是一種具有地域特色的水生蔬菜，主要以其膨大的肉質球莖供食用，有些種類的葉柄和花梗也可作蔬菜食用。芋屬典型的無性繁殖作物，多采用球莖繁殖，在其長期的無性繁殖過程中，植株中病毒數量不斷積累、種類不斷增加，導致病毒病為害逐年加重，且品種退化嚴重，造成芋產量和品質下降。隨著我國芋種植面積逐步增大，芋病毒病在我國栽培芋上發生越來越普遍[1]，因此防治芋病毒病已引起人們的高度重視。前期研究表明，侵染芋植株的病毒達8種之多[2～6]，國內報道的有芋花葉病毒（DsMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）2種，其中DsMV分布最廣，為害最大[6]。本研究主要對湖北及山東種植芋的病毒病進行了相關田間調查，并對其主要病原病毒DsMV進行了RT-PCR檢測，以期為生產實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 芋病毒病田間調查

2010年4～11月對湖北武漢華中農業大學周邊、蔡甸馬家渡、蔡甸索河鎮、武漢蔬菜科學研究所、仙桃、山東臨沂等地種植的水芋及旱芋進行了田間調查并采集病樣，選取武漢蔬菜科學研究所國家種質武漢水生蔬菜資源圃所種植的芋進行病毒病癥狀調查，記錄不同癥狀顯癥株數并計算發生頻率。

1.2 芋花葉病毒的RT-PCR檢測

①樣品來源 從湖北及山東收集芋葉片樣品共81份，其中多數樣品植株的葉片表現花葉或羽狀斑駁等癥狀。

②所用引物 用于該病毒檢測的引物為DsMV-1/DsMV-2：5'-GGGCTTGGGTGATGATGGA-3'/5'-GCCTTTCAGTGTTCTCGCTTG-3'，根據陳集雙[7]的報道合成序列，其擴增片段為357 bp，擴增區域為cp基因中間部分核心序列；所用引物由上海生工生物技術有限公司合成。

③總RNA提取 取待檢材料嫩葉0.1 g，加液氮研磨成粉狀，快速轉入1.5 mL離心管中，加入1 mL RNA提取緩沖液 （含50%異硫氰酸胍、5 mol/L苯酚等），劇烈混勻，室溫靜置5 min后離心，上清液經氯仿抽提2次后，加入2/3體積的異丙醇沉淀核酸，沉淀物經75%乙醇洗滌2次，風干后，溶于30 μL DEPC處理水中，-20℃保存。

④RT-PCR 以提取的總RNA為模板，合成cDNA第1鏈，反應體系為20 μL，含5×反轉錄沖液4 μL、dNTPs（5 μmol/μL）1 μL、Rnasin（40 U/μL）0.5 μL、M-MLV（200 U/μL）0.5 μL、隨機引物（100 pmol/μL）1 μL、RNA模板3 μL和DEPC處理水10 μL。PCR反應總體系為25 μL，含10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（5 μmol/μL）0.5 μL、Taq DNA聚合酶 （5 U/μL）0.2 μL、正反向引物各0.5 μL（10μmol/μL）、cDNA2μL和滅菌的去離子水18.8 μL。擴增條件為：94℃變性3 min；然后94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳后在溴化乙錠中染色10 min，最后凝膠成像、觀察結果。

2 結果與分析

2.1 芋病毒病田間調查結果

調查發現田間芋病毒病發生普遍，發病重的田塊田間病毒病顯癥率達50%以上。芋從苗期（4月）到收獲期 （11月）的整個生長期內均表現出病毒病癥狀，其中在生長盛期（6～8月）癥狀表現最為明顯。癥狀表現主要有花葉、羽狀斑駁、畸形皺縮、矮化、黃化、褪綠斑點等（圖1），其中水芋表現以花葉為主，旱芋病癥則表現多樣。2010年9月30日調查武漢市蔬菜科學研究所國家種質武漢水生蔬菜資源圃種植的旱芋病毒病癥狀統計情況見表1。田間調查時未發現蚜蟲等為害芋的媒介昆蟲。

圖1 芋病毒病田間癥狀

表1 武漢蔬菜科學研究所國家水生蔬菜資源圃的芋病毒病癥狀田間調查統計結果

2.2 DsMV的RT-PCR檢測結果

對來自湖北的79份芋葉片樣品進行了DsMV的RT-PCR檢測，部分樣品中檢測到357 bp的目標片段（圖2），對目標片段進行回收、克隆、測序，序列比對確定其為DsMV。檢測結果顯示，湖北不同地區樣品的DsMV檢出率為21.1%～42.9%，其中來自湖北蔡甸2個種植園的17份樣品的DsMV檢出率相對較高，為30.0%～42.9%；來自山東臨沂的3份隨機收集樣品中未檢測到該病毒，所有樣品總檢出率為24.7%（表2）。

3 小結與討論

調查中發現，芋病毒病從北到南發生逐步加重，水芋比旱芋發病重，可能與氣候、品種的抗性、栽培方式、生長環境等有關。北方以旱芋種植為主，因氣候寒冷干燥，不利于病毒的增殖，故病毒病為害發生較輕；因水芋產量較旱芋高，南方以水芋種植為主，南方氣候溫暖濕潤，利于病毒的增殖和傳播，加上水芋栽培中傳統的大水大肥的管理模式導致水芋病毒病發生嚴重。

圖2 部分芋葉片DsMV RT-PCR產物凝膠電泳結果（M：Marker II；1～8：待檢樣品；9：空白對照）

表2 不同來源芋的DsMV RT-PCR檢測結果

本研究中，與芋植株病毒病顯癥率相比，DsMV的檢出率明顯偏低，且低于前人的報道[6]，而且DsMV的檢出結果和樣品顯癥情況無明顯相關性，有些顯癥明顯的樣品未檢出DsMV，而有些檢出DsMV的樣品無明顯病毒病癥狀，這與前人研究結果一致[8]。造成此結果的原因可能有以下幾種：芋病毒病原存在著混合侵染現象，造成芋病毒病癥狀的病原可能有多種，而本研究只檢測了分布最廣、為害最大的DsMV，其他表現病毒病癥狀但未檢出DsMV的樣品可能是其他病原侵染所致。而且據前人報道[9]，DsMV也存在著較高的分子多樣性，可能存在著多種株系，而本研究所用的RT-PCR技術較高的特異性可能也導致了DsMV較低的檢出率。另外，DsMV侵染芋植株的顯癥機理尚不清楚，有待進一步研究。

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[8]陳集雙，李德堡.我國13種天南星科作物上的芋花葉病毒[J].微生物學報，1996，36（2）：126-131.

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Field Investigation of Viral Disease and Molecular Detection of Pathogenic Virus on Cultivated Taro[Colocasia esculenta(L.)Schott]in Hubei and Shangdong

SHI Shiming,HONG Ni
(College of Plant Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070)

Field investigation of cultivated taro [Colocasia esculenta(L.)Schott]in Hubei province were carried out.The results showed that taro viral diseases were happened widespread,with the main symptoms of mottle-leaf,pinnate mottle, deformity shrinks and chlorotic spots.The rates of 4 symptoms occurring were 26.92%,16.67%,28.21%and 3.85%when the investigation conducted in the National Aquatic Vegetables Resources Nursery of Wuhan Vegetables Research Institute on the September 30th,2010.No insect vectors such as aphid were found in the investigation.RT-PCR was implemented to detect DsMV of taro from Hubei.The results showed that the rates of 4 symptoms occurring ranged from 21.1% -42.9%.

Colocasia esculenta;Viral diseases;Field investigation;Dasheen mosaic virus;Molecular detection

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.028

公益性行業（農業）科研專項（200903017-08）施世明（1986-），男，碩士，研究方向為植物病毒學

洪霓，教授，通信作者，研究方向為植物病毒學，電話：027-87283278，E-mail：whni@mail.hzau.edu.cn

2011-07-10