茭白黑粉菌脈沖電泳分析方法

王曉清，張敬澤，褚福強，張艷麗，郭得平

（浙江大學農業與生物技術學院，杭州，310058）

茭白黑粉菌脈沖電泳分析方法

王曉清，張敬澤，褚福強，張艷麗，郭得平

（浙江大學農業與生物技術學院，杭州，310058）

采用脈沖電泳法對茭白黑粉菌染色體進行核型分析。分析結果表明，茭白黑粉菌脈沖電泳樣品處理方法包括原生質體的制備、電泳參數的設置等，對試驗結果有一定影響，在制備電泳樣品時，包埋的原生質體或孢子的濃度不能太低，蛋白酶K的濃度不能過高，低熔點瓊脂糖的濃度不能太低，此外還應確保電泳槽水平，并且電泳結束后及時取出凝膠。

茭白黑粉菌；原生質體；脈沖電泳；核型分析

在茭白（Zizania latifoliaTurcz.）生長期間，茭白黑粉菌（Ustilago esculentaP．Henn.）與茭白植株共生，并在茭白植株體內分泌代謝產物刺激茭白莖基部膨大形成肉質莖[1]。茭白黑粉菌誘導茭白莖膨大的機制目前還不清楚，主要與茭白黑粉菌和植株互作的分子機制研究缺少有關，因此，深入研究其分子生物學特性亟待進行。

核型是指動物、植物、真菌等真核生物的某一個體或某一分類群的細胞內染色體組中染色體的數目、大小和形態[2]。明確基因組染色體數目和大小是基因組分析的基礎工作，對搞清基因組DNA的全部核苷酸順序結構，識別所有基因的編碼，測定基因的位置及它們的功能有重要意義，是分子生物學乃至整個生命科學領域一項十分重要的基礎性工作[3]。

由于真菌染色體較小以及可能獲得的遺傳標記較少，因此難以用傳統的染色體技術和光學顯微鏡觀察或通過基因間建立遺傳學連鎖關系的方法對其進行測定。脈沖電泳技術可分離大分子量的DNA的極限為10 Mb，為真菌染色體的研究提供了技術平臺[4]。脈沖電泳廣泛用于真菌的核型分析，通過它可以直接得到真菌染色體的數目，每條染色體分子量以及染色體總量。本方法參考了多位前人脈沖電泳的方法，采用改進的脈沖電泳法對茭白黑粉菌染色體組進行核型分析。

1 材料與方法

1.1 材料準備

取已分離、純化的茭白黑粉菌單孢菌落，接種于液體培養基中，在28℃，180 r/min條件下搖瓶。培養 48 h后，將培養基倒入 50 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min，收集孢子。

液體培養基：蔗糖10 g，葡萄糖10 g，L-Asp 2 g，馬鈴薯200 g，水1 000 mL。按照各物質使用濃度要求加入青霉素、鏈霉素、維生素B1。

1.2 主要試劑及儀器

STC緩沖液：0.05 mol/L Tris-His（pH=8.0），0.05 mol/L CaCl2，0.8 mol/L山梨醇；酶液：用0.7 mol/L NaCl配制10 mg/mL溶解酶 （Sigma）+10 mg/mL崩潰酶（Sigma）+10 mg/mL蝸牛酶（北京拜爾迪生物技術有限公司）的混合酶液后，8 800 r/min離心，上清液用直徑0.22 μm過濾器過濾除菌，現配現用。

蛋白酶K緩沖液：100 mmol/L EDTA（pH= 8.0）、1%月桂酰肌氨酸、0.2%脫氧膽酸鈉、1 mg/mL蛋白酶K[5]。

SCE緩沖液：1 mol/L山梨醇，20 mmol/L檸檬酸鈉（pH=5.8），10 mmol/L EDTA。

低熔點瓊脂糖、蛋白酶K、Tris、EDTA、溴化乙錠、高強度瓊脂糖、月桂酰肌氨酸、脫氧膽酸鈉均購自上海生工生物工程技術服務有限公司，其他試劑均為分析純。

表1 電泳參數設置

主要儀器有水平搖床、低溫離心機、具有Axiocam CCD攝像頭和Axiovision數字成像軟件（Axio Vision Software Release 3.1.， Carl Zeiss Vision Imaging Systems）的Zeiss Axiophot 2顯微鏡、電泳系統（Bio-Rad CHEF Mapper）、數碼凝膠成像系統（Fine-do X3）。

1.3 茭白黑粉菌原生質體的獲得

①將離心收集到的孢子用無菌水振蕩、離心洗滌2次。再用0.7mol/LNaCl溶液振蕩、離心洗滌1次。

②盡量倒干水分，加入酶液（菌體∶酶液=1 g∶10 mL），搖動以混合均勻。30℃，100 r/min酶解3 h[6]。30 min后觀察有無原生質體釋放，以后每隔30 min觀察1次。

③酶解后的原生質體用4層擦鏡紙過濾，過濾前先用STC緩沖液潤濕擦鏡紙，過濾完后用STC緩沖液沖洗擦鏡紙。

④將收集到的濾液4 000 r/min，4℃離心10 min，移液槍吸取上清，檢查是否有原生質體。若上清有原生質體，再次離心。至上清無原生質體時，棄上清，收集沉淀的原生質體。分別用0.7 mol/L NaCl溶液和STC緩沖液離心洗滌收集到的原生質體1次。

⑤向離心收集的原生質體中加入1 mL STC緩沖液，輕輕混合均勻，用血球計數板計數。用STC緩沖液調至原生質體濃度大約為108個/mL，然后立即42℃預熱備用或加甘油于-80℃冰箱中保存。

1.4 電泳樣品準備

①將450 μL 42℃預熱的原生質體懸浮液與750 μL預冷至42℃的1%低熔點瓊脂糖溶液 （用STC緩沖液配制）混合均勻，用移液槍吸取混合物于模子中，避免產生氣泡。每個模子80 μL，室溫凝固15 min左右[7]。

②一旦凝固，在50 mL離心管上做好標記，每管加入20 mL蛋白酶K緩沖液。打開模具，將膠塊移入相應的管子中，50℃水浴，24 h[5]。

③棄去溶液，用 10 mmol/L Tris（pH=8.0）和50 mmol/L EDTA的混合液洗膠塊4次，共1 h，輕微震蕩。

④洗完后，將膠塊放在0.5 mol/L EDTA（pH= 8.0）中，30 min后將膠塊保存在4℃，新的0.5 mol/L EDTA（pH=8.0）中。

1.5 進行脈沖電泳

①調整梳子的高度，使梳子齒與膠槽的底面有一定間距，調整膠槽使其水平。

②將EDTA從管中吸出，加入200 μL電泳緩沖液，室溫緩沖10～15 min。

③稱取高強度瓊脂糖于100 mL電泳緩沖液中，加熱溶解后冷卻至60℃。

④把膠塊加在梳子齒上，干燥約3 min后，從膠槽的下部中央緩慢倒入配制好的瓊脂糖溶液，室溫凝固30 min。

⑤小心拔去梳子，加緩沖液于電泳槽中，用熔化的膠封閉加樣孔，設置參數開始電泳（表1）。

⑥據每次分離染色體片段大小選定Marker。

1.6 染色拍照

①電泳結束后，用0.5 μg/mL的溴化乙錠電泳緩沖液或水進行凝膠的染色，30～45 min。

②室溫下用水將已經染色的凝膠浸泡30 min脫色，可以降低由未結合的溴化乙錠所引起的背景熒光。

③數碼凝膠成像系統觀察染色體大小、數目，并拍照。

2 操作中應注意的事項

①制備電泳樣品時，包埋的原生質體或孢子的濃度不能太低。若其濃度太低，則電泳的條帶較暗。

②蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高，都會對細胞的結構有一定的破壞，導致組織切片的脫落，細胞核的消失，從而影響試驗結果。

③低熔點瓊脂糖的濃度不能太低。若其濃度較低，則會形成較大的孔道，電泳后可能看不到任何條帶；若其濃度太高，則瓊脂糖很容易凝固，不利于操作。

④要確保電泳槽是水平的。電泳結束后，及時取出凝膠，防止因時間過長，造成條帶彌散。

3 小結與討論

不同的電泳參數跑出來的凝膠條帶個數是不同的，若條帶中有異常的明亮條帶出現，證明此處很可能是分子量相同或相近的兩條染色體重合在一起。需要再重新設置電泳參數，以分離重疊的染色體條帶。明亮的帶可能會隨著電泳條件的改善而出現更清晰的結果[9]。電泳過程是一個極其復雜的過程，很多因素制約著試驗結果的好壞。影響脈沖電泳分離效果的因素主要包括：電流強度、電泳溫度、瓊脂糖濃度、脈沖時間以及電場角度等[10～11]。在篩選電泳的影響因素時首先確定一個電泳條件，然后根據試驗結果，依次更改各個因素，以達到最佳效果[12]。

制備原生質體法是完整染色體DNA獲得中最經典的方法，適用范圍較廣[12]。但重要的是試驗中要獲得較高濃度的原生質體，因此要對原生質體的制備條件進行摸索。另外還可以采用液氮研磨法，此方法無須用溶壁酶破壁，這就使得制備完整染色體DNA的過程大大簡化，因此有很好的發展前景。但不足的地方在于研磨菌絲體過程中極可能導致染色體DNA斷裂。該方法要求試驗操作者有較好的試驗操作經驗。

本技術用于分離茭白黑粉菌的染色體，可以探索茭白黑粉菌的染色體大小和數目。為其之后的細胞學和遺傳學的深入研究提供條件，將極大地推動茭白黑粉菌分子生物學方面的研究。但該試驗方法是對茭白黑粉菌核型分析方面的首次探索，仍需在今后的研究中不斷改進。

[1]余永年.茭白黑粉菌刺激生長物質的研究[J]．植物學報，1962，12（3）：317-327．

[2]吳甘霖.核型分析在細胞分類學中的應用[J]．生物學雜志，2006，23（1）：39-42．

[3]付曉燕，胡克興，范黎.脈沖場凝膠電泳技術及其在真菌學研究中的應用[J]．微生物學通報，2006，33（1）：144-148.

[4]Schwartz D C,Cantor C R.Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis[J].Cell,1984,37:67-75.

[5]Ellwood S R,Liu Z H,Syme R A,et al.A first genome assembly of the barley fungal pathogen Pyrenophora teres f. teres[J].Genome Biology,2010,11:R109.

[6]管培剛.棉花黃萎病菌GFP標記轉化子的特征及其病害的生物防治[D].杭州：浙江大學，2011.

[7]Guzmán P A and Sánchez J G.Characterization of telomeric regions from Ustilago maydis[J].Microbiology,1994,140: 551-557.

[8]Meksem K,Shultz J,Tebbji F,et al.A bacterial artificial chromosome based physical map of the Ustilago maydis genome[J].Genome,2005,48:207-216.

[9]榮躍文，徐莉，汪小艷，等.高雄山蟲草無性型細腳擬青霉的核型分析[J].菌物學報，2010，29（1）：31-36.

[10]Vollrath D,Davis R W.Resolution of DNA molecules greater than 5 megabases by contour-clamped homogeneous electric fields[J].Nucleic Acids Research,1987,15 (19):7 865-7 876.

[11]Chu G,Vollrath D,Davis R W.Separation of large DNA moleculesby contour-clamped homogeneouselectric fields[J].Science,1986,234(4783):1582-1585.

[12]汪小艷.幾株蛹草擬青霉原生質體制備及染色體核型研究[D].合肥：安徽農業大學，2010.

Protocol for pulsed field gel electrophoresis ofUstilago esculenta

WANG Xiaoqing,ZHANG Jingze,CHU Fuqiang,ZHANG Yanli,GUO Deping
(College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058)

Karyotype ofUstilago esculentawas analyzed by pulsed field gel electrophoresis.The experiment results were affected by the sample treatment methods of pulsed field gel electrophoresis ofU.esculenta,including protoplast preparation and entrapment.While preparing the test samples,the concentration of embedded protoplast or spore and low melting point agarose can't be too low,and the concentration of proteinase K can't be too high.In addition,the electrophoresis tank should be placed horizontally,and the gel should be taken out timely after the electrophoresis.

Ustilago esculenta;Protoplast;Entrapment;Pulsed field gel electrophoresis;Karyotype

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.029

公益性行業（農業）科研專項經費項目“水生蔬菜產業技術體系研究與示范”（200903017-03）

王曉清（1988-），女，碩士，主要從事蔬菜學研究，電話：0571-88982796，E-mail：xccghh_620@163.com

郭得平，通信作者，E-mail：dpguo@zju.edu.cn

2011-07-11