血紅素加氧酶-1重組乳酸乳球菌灌胃對正常大鼠腸黏膜屏障的影響

高新躍 任從才 韓京軍

血紅素加氧酶-1(HO-1)，是HO家族中最重要的酶，為誘導型酶［1］。生理狀態下，消化道中的HO同工酶主要為HO-2，而HO-1在腸組織中不表達，只有在缺血缺氧等刺激下才開始分泌HO-1［2，3］。本實驗室已經證明，利用基因工程原理合成HO-1重組乳酸乳球菌，對正常大鼠灌胃后能夠到達回腸組織，原位分泌大量重組HO-1，對失血性休克和/或內毒素血癥大鼠，有較好的腸黏膜屏障保護效應，明顯減少腸道炎癥反應的發生程度［4-9］。同時也證明，HO-1重組乳酸乳球菌對正常大鼠灌胃，單純增加灌胃劑量和次數不能有效增加回腸

HO-1的表達，反而可能使回腸HO-1的表達降低［10］。本實驗在上述實驗的基礎上，進一步研究HO-1重組乳酸乳球菌對正常大鼠灌胃后，是否影響腸黏膜屏障功能?

1 資料與方法

1.1 藥品和試劑 HO-1重組乳酸乳球菌，本實驗室構建合成。磷酸鹽緩沖液(PBS)，湖北省武漢博士德生物試劑有限公司出品;乳酸乳球菌素(Nisin)，美國Sigma公司出品;髓過氧化物酶(MPO)活性試劑盒，江蘇省南京建成生物試劑公司出品，其余試劑為市售。

1.2 動物分組 健康、清潔級標準的雄性SD大鼠40只，體重在280～320 g之間，由江蘇省徐州醫學院實驗動物中心提供。根據數字隨機表法分為5組:HO-1重組乳酸乳球菌灌胃1次組(HO1t組，n=8)、HO-1重組乳酸乳球菌灌胃2次組(HO2t組，n=8)、HO-1重組乳酸乳球菌灌胃三次組(HO3t組，n=8)、PBS溶液灌胃1次組(PBS1t組，n=8)和乳酸乳球菌灌胃1次組(LL1t組，n=8)。各組灌胃劑量的容積均為1 ml，每次灌胃間隔24 h。所有動物均在實驗前適應飼養環境7 d，自由飲食，單獨飼養。飼養環境和實驗室環境溫度保持在22℃ ～25℃之間。

1.3 灌胃劑量 將Nisin誘導表達3 h的HO-1重組乳酸乳球菌，離心(8000 g，5min)收獲菌液，PBS洗3次(10000 g，1 min)棄上清后，再加入適量的PBS使菌液濃縮10倍(活菌數達5×109CFU/ml)，用1 m l的細菌懸浮液作為一次灌胃的劑量。在同樣條件下培養未轉染的乳酸乳球菌NZ9000，取1 ml的細菌懸浮液作為一次灌胃的劑量。PBS溶液灌胃一次組，用1 ml PBS溶液做為灌胃劑量。

1.4 組織標本的收集 于末次灌胃后24 h，使用過量水合氯醛麻醉動物，無菌條件下打開胸腹腔，從大鼠的右心室抽取2 ml-3 ml的血液注入血培養瓶中。另距回腸末端取下5 cm長度的一段回腸，其中1 cm用10%甲醛溶液浸泡，余下的回腸立即保存在-80℃冰箱內。

1.5 檢測指標

1.5.1 組織學檢查 光鏡(100倍)下觀察腸黏膜形態，采用Chiu’s 6級評分法評價腸黏膜損傷程度:0分為正常;1分為絨毛頂端上皮下間隙增大;2分為上皮層和固有層中度分離;3分為絨毛兩側有大量分離伴有部分絨毛頂端破損;4分為絨毛破損伴有固有層毛細血管大量暴露;5分為固有層破壞、出血及潰瘍。

1.5.2 腸組織MPO活性 采用比色法測量腸組織內的MPO活性，MPO活性大小主要反映組織內的中性粒細胞(PMN)數量，具體操作按照說明書進行。

1.5.3 細菌移位 將抽取的1 ml血液立即注入血培養瓶中，利用 BACTEC9120全自動血培養儀和 Bacton Dickinson Bactec 9000軟件發現有細菌生長的血培養瓶，然后再利用生物梅里埃APR鑒定系統鑒定細菌種類。

1.6 統計學方法 對于定量數據，采用均數±標準差，組內比較用t檢驗，組間比較用單因素方差分析;使用SPSS 13.0英文版統計軟件進行統計分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織學檢查 各組腸黏膜Chiu's評分比較無統計學意義，提示各灌胃組對腸道無損害作用。

2.2 腸組織MPO活性的比較 如表1所示:與LL1t組比較，HO2t組和PBS1t組的腸組織內MPO活性較高，但差異無統計學意義(P＞0.05);與LL1t組比較，HO1t組和HO3t組的MPO活性無明顯變化，差異無統計學意義(P＞0.05);說明各灌胃組對腸道組織MPO的影響相似。

表 1 HO1t組、HO2t組、HO3t組、PBS1t組和LL1t組組腸組織MPO活性結果(x±s，MPO活力單位/克濕片)

2.3 細菌移位 HO1t組、PBS1t組和LL1t組血培養陰性，HO2t組有1例、HO3t組有2例血液細菌培養陽性，移位的細菌按出現次數依次為:大腸桿菌、木糖葡萄球菌、類白喉棒狀菌等。

3 討論

腸道功能的改變，首先表現為腸黏膜形態的變化，出現黏膜水腫和絨毛斷裂，發生腸黏膜屏障功能減退。通過Chiu's評分可以判斷出腸黏膜受損情況，是反映其功能改變的形態學指標［11］。

在失血性休克期，腸道內的正常菌群依賴腸道內的營養物質大量繁殖，細菌和(或)其釋放的內毒素通過受損的腸黏膜屏障轉移到腸道外，這個過程稱之為細菌移位。細菌移位導致的炎癥介質釋放，明顯比腸道因缺血缺氧刺激引起的炎癥介質釋放要多［12］。炎癥介質通過激活各種信號通路如激活NF-kB信號通路，導致腸道炎癥反應引起腸黏膜屏障功能的改變，甚者引起全身炎癥反應綜合(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)［13］。

PMN作為人體主要的免疫細胞，發揮重要的免疫防御功能，擔負著吞噬消滅外來細菌、病毒及其他微生物的使命。正常情況下，腸道內皮細胞通過細胞間連接和粘附功能，形成有效的腸黏膜屏障，使機體免于外界傷害因素的損害。而在病理情況下，大量活化的PMN通過偽足的機械作用和釋放各種氧化物質(ROS)，造成腸黏膜屏障受損，發生腸黏膜水腫和腸黏膜屏障功能減退，這是腸道炎癥反應發生的重要機制。而機體則分泌具有保護性機制的酶類［14］，如HO-1。HO-1的保護作用包括:抗炎癥反應、抗凋亡、抗纖維化［15］，其保護機制與HO-1降解血紅素的代謝產物CO、膽綠素、膽紅素、鐵蛋白相關。

另外一些研究發現，細胞中HO-1的保護作用是有閾值的。HO-1適量表達，可以減少蛋白質氧化、脂質過氧化及細胞死亡;表達量過高時，則會促進乳酸脫氫酶的釋放和降低谷胱甘肽轉移酶含量，破壞細胞膜的完整性［16］。

本實驗室采用的乳酸菌表達系統是一種目前國際上高度通用、食品級的NICE系統(Nisin Controlled Expression system)，被廣泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表達［17］，這種食品級微生物能在腸道內存活2～3 d，其本身不攻擊腸黏膜并且不引起強的免疫反應［10］。通過外源性的補充腸道內的乳酸乳球菌，可以將它攜帶的克隆基因帶到腸道內，發揮藥理作用。

本研究條件下，各組Chiu's評分和MPO的差異無統計學意義，說明腸黏膜屏障功能沒有發生明顯變化。HO2t組和HO3t組發生細菌移位，這可能與大量乳酸乳球菌在腸道內形成的酸脅迫有關［18］，從而對局部細胞的生理功能產生影響，包括破壞細胞膜，抑制多種酶和轉運系統的活性等［19］，但這種細菌移位的發生后果以及可能導致的并發癥，本研究沒有深入值得探討。因此，在如何提高乳酸工程菌體內分泌重組HO-1的含量，同時不改變胃腸道微環境、破壞腸黏膜屏障等方面需要進一步研究，使乳酸工程菌的基因治療達到一個理想的效果。

4 結論

本研究條件下，HO-1重組乳酸乳球菌對正常大鼠灌胃，不會隨著灌胃次數增加而影響腸黏膜屏障的功能。

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