復方丹參注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響

陳建珍 葉 蓓 (蘇州衛生職業技術學院護理系,江蘇 蘇州 215009)

缺血再灌注性腦損傷所致神經元的壞死與凋亡是腦缺血導致細胞損傷的主要標志,同時還是反映治療效果的重要指標〔1〕。細胞凋亡的通路中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)是凋亡的啟動者和執行者,其活性增加導致神經細胞的凋亡〔2〕。國內研究報道丹參對缺血缺氧性腦損傷具有防治作用〔3〕。但丹參針對神經細胞凋亡保護作用的機制及保護區域報道較少。海馬對缺血具有較高的敏感性和高度的選擇性〔4〕。本實驗旨在探討丹參對神經細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器 正常健康 SD大鼠50只,體質量250～300 g,雌雄不限。復方丹參注射液為麗珠集團利民制藥廠提供,批準文號:國藥準字 263024779;Hoechst33258熒光染色試劑盒由南京建成有限公司提供;caspase-3多克隆抗體,鏈霉親合素-生物素-過氧化物復合物法(SABC)免疫組化染色試劑盒,二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒,均由武漢博士德生物工程有限公司提供。Leica恒冷箱切片機(德國),Olympus熒光顯微鏡(日本),捷達形態學分析系統(江蘇捷達科技有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 實驗動物隨機分為 3組:(1)假手術組(對照組)(n=8);(2)腦缺血再灌注組(n=21);(3)復方丹參組(n=21);除第 1組外其余兩組分為術后 12、24、48h 3個時點,每個時點 7只大鼠。大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型的制備采用大腦中動脈內線栓阻斷法(middle cerebral artery occlusion,MCAO),阻斷血流1 h后,拔線實現再灌注。假手術組動物除不插線外,其他操作同模型制備步驟。復方丹參組在手術前(缺血再灌注造模前)30 min,腹腔注射復方丹參注射液,劑量為 5 g/kg。動物模型制作成功標準:動脈夾夾閉雙側頸總動脈后,各只大鼠均發生呼吸急促,心跳加快。大鼠清醒后,出現追尾癥,運動時軀體向左側旋轉。

1.2.2 取材和切片 各組大鼠按實驗設計的時間點斷頭處死,開顱取腦,選取含海馬、齒狀回的腦組織用冷凍包理劑(OCT)包埋后入液氮速凍,應用恒冷箱切片機連續冠狀切片。

1.2.3 Hoechst 33258熒光染色 切片采用 4℃冷丙酮固定5 min,經蒸餾水稍洗后,滴加 Hoechst 33258染色液染色 5 min。然后經蒸餾水洗片,去除多余液體。在熒光顯微鏡下,以 U激發為激發條件,在 200倍視野中進行觀察和拍照。

1.2.4 caspase-3免疫組化染色 免疫組化按試劑盒提供的實驗步驟進行,切片經新鮮二甲苯脫蠟,3%過氧化氫孵育10 min,0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡 5 min,滴加 1∶100 caspase-3多克隆抗體,余步驟同試劑盒說明書,以已知陽性切片作為陽性對照,PBS液置換一抗作為陰性對照。每批切片分別制作 1張陽性對照和 1張陰性對照切片。

1.2.5 體視學分析 每只動物隨機分別選取 5張 Hoechst 33258熒光染色和 caspase-3免疫組化染色切片,分別于左、右兩側海馬 CA 1、CA 2、CA3、CA 4區、齒狀回隨機選取多個視野,在 200倍鏡中觀察拍照。用高清晰度彩色病理圖文分析系統分別測量參照系(海馬區細胞比較集中在錐體層和多行層,齒狀細胞比較集中在回顆粒層和多行層)總截面積(Ar),凋亡細胞的總截面積(Ax),根據體視學公式:體密度(Vv)=Ax/Ar,測算出凋亡細胞的 Vv。平均體積(V)測算:用圖像分析系統測量凋亡細胞的平均直徑(D),根據體視學公式:V=(4π/3)?(D/2)3,測算細胞的V。根據體視學公式:數密度(Nv)=Vv/V,測算細胞的 Nv。

1.3 統計學分析 應用 SPSS 13.0統計軟件,對單因素計數資料采用 χ2檢驗,計量資料采用t檢驗。

2 結 果

2.1 Hoechst 33258熒光染色結果 熒光染色顯微鏡下可見凋亡細胞的細胞核呈現明亮鮮艷的藍色熒光,正常細胞核為暗藍色,顏色較深。對照組中海馬區和齒狀回區中可見極少量明亮的藍色熒光的凋亡細胞;缺血再灌注組海馬CA1、CA 2區大量分布明亮的藍色熒光的凋亡細胞,部分凋亡細胞核聚縮,呈不規則形態,其他部位相對較少;在丹參組海馬區和齒狀回區仍可見發出明亮熒光的凋亡細胞,但數量較模型組明顯減少。見圖1。

2.2 caspase-3免疫組化結果 鏡下可見凋亡細胞胞質、胞核呈棕黃色細顆粒狀。對照組中海馬區和齒狀回區中偶見陽性表達的凋亡細胞;缺血再灌注組中海馬CA1、CA2區可以清晰看見陽性表達的凋亡細胞多在錐體層,齒狀回未見表達;在丹參保護組海馬區和齒狀回區仍可見陽性表達的凋亡細胞,但數量較模型組明顯減少。見圖 2。

圖1 各組熒光染色結果(×200)

圖2 各組 caspase-3免疫組化結果(×200)

2.3 體視學分析結果 各組大腦各部位平均Hoechst 33258熒光染色顯示的凋亡細胞及平均caspase-3陽性表達細胞的Vv和 Nv結果。見表 1,表 2。

表1 各組平均Hoeehst33258熒光染色凋亡細胞 Vv(×10-2μm3/μm3,±s)

表1 各組平均Hoeehst33258熒光染色凋亡細胞 Vv(×10-2μm3/μm3,±s)

與模型組比較:1)P＜0.05,下表同

組別 CA1 CA2 CA 3 CA4 齒狀回區對照組 0.89±0.23 0.74±0.36 0.68±0.14 0.74±0.23 0.95±0.32缺血再灌注組 7.31±1.24 6.74±1.14 3.21±0.70 3.40±1.05 2.15±0.61復方丹參組 4.36±1.181)3.27±0.631)2.65±0.86 2.27±0.79 1.36±0.60

表2 各組平均 caspase-3陽性表達的凋亡細胞 Nv(×10-2μm3/μm3,±s)

表2 各組平均 caspase-3陽性表達的凋亡細胞 Nv(×10-2μm3/μm3,±s)

組別 CA1 CA2 CA 3 CA4 齒狀回區對照組 1.45±0.24 1.48±0.19 1.46±0.25 1.62±0.30 1.15±0.31缺血再灌注組 6.21±0.51 7.33±1.60 3.51±0.98 3.49±0.88 2.87±1.24復方丹參組 3.27±0.691)3.96±0.221)2.41±0.78 2.73±0.71 2.24±0.33

3 討 論

細胞凋亡發生發展是一個復雜的、由caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應過程〔5〕。caspase-3作為細胞凋亡的關鍵蛋白水解酶,它的激活是凋亡過程中的核心環節,并且是所有凋亡途徑的最后效應因子,它能夠激活脫氧核糖核酸酶,裂解DNA成碎片,導致細胞凋亡〔6〕。 Hoechst 33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料,對細胞毒性較低,染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀測定,常用于細胞凋亡的檢測。因此本研究采用 Hoechst 33258熒光染色和免疫組化方法檢測caspase-3,觀察海馬、齒狀回細胞凋亡情況。大鼠腦缺血發生時,缺血缺氧激活了細胞凋亡基因的表達,再灌注后大量氧自由基對細胞造成嚴重損傷的同時誘導細胞凋亡的發生,同時鈣超載激活一系列鈣依賴性酶促反應,促進了細胞凋亡的發生〔7〕。海馬 CA1、CA2區作為腦缺血再灌注的損傷區域,腦缺血再灌注后導致細胞質內鈣離子增多,激活鈣依賴性酶促反應,將 DNA破壞形成細胞凋亡的特征〔8〕。本實驗結果顯示:經腦缺血再灌注后凋亡神經細胞主要分布于缺血側海馬 CA1、CA2區,而腦組織其他區域凋亡細胞明顯較少,其原因可能是海馬是腦缺血敏感的部位,其中海馬CA1、CA2區細胞對缺血特別敏感,短暫性腦缺血發作后CA1、CA 2區的細胞發生選擇性遲發性死亡,而齒狀回、其他區域的細胞對缺血相對抵抗〔9〕;海馬缺血區域和齒狀回神經細胞caspase-3的活性在缺血再灌注后逐漸降低,可能是神經細胞自我保護機制發揮作用,caspase-3活性的降低限制和減少了腦缺血再灌注后細胞凋亡的發生、發展過程〔10〕。目前許多實驗研究表明丹參具有改善缺血再灌注損傷腦神經功能缺損、改善微循環、降低腦血管通透性、抑制神經細胞凋亡、阻止鈣超載、清除氧自由基〔11〕、抗脂質過氧化等作用〔12〕。本實驗結果表明在丹參注射液保護組,大鼠缺血側海馬 CA1、CA2區和齒狀回凋亡神經細胞數明顯減少,神經細胞caspase-3活性顯著降低,說明丹參注射液對腦缺血再灌注后神經細胞 caspase-3的激活有抑制作用。丹參注射液通過抑制 caspase-3的激活,阻斷神經細胞凋亡通路,同時減少氧自由基的形成,降低腦缺血再灌注后腦細胞的凋亡數量,保護受損腦細胞,這可能是丹參注射液對抗腦缺血再灌注損傷的機制之一。

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