汾酒酒醅發酵過程中有機酸的變化規律

曹云剛，馬 麗，杜小威，張生萬,*

(1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽 032205)

汾酒酒醅發酵過程中有機酸的變化規律

曹云剛1，馬 麗1，杜小威2，張生萬1,*

(1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽 032205)

采用氣相色譜衍生化法和氣相色譜-質譜分析法，跟蹤考察汾酒發酵過程酒醅中有機酸的動態變化規律，同時利用酸度計和酸堿中和法考察酒醅pH值及總酸度隨發酵時間的變化規律。結果發現：酒醅酸度隨發酵的進行整體呈快速上升趨勢，9～11d略有下降，發酵結束后酒醅pH值下降至3.3左右，總酸度升高了約25度；酒醅中有機酸以乳酸含量最高，占支配地位，乙酸含量次之，其含量均隨發酵的進行整體呈上升趨勢，在發酵后期乳酸含量為同期乙酸含量的10倍以上；各有機酸在酒醅中的質量比與在成品白酒中存在一定的差異。本研究提出縮短汾酒夏季大茬發酵時間為9d左右，并相應增加發酵輪次，以解決酸敗問題并縮短發酵時間的理論設想。

酒醅；有機酸；衍生化；氣相色譜；氣相色譜-質譜；總酸度

白酒是我國特有的蒸餾酒，其酒質澄清透明，氣味芳香純正，入口綿甜爽凈，與白蘭地、威士忌等并稱為世界七大蒸餾酒。白酒發酵過程與酒醅中微生物生長代謝緊密相關，隨著發酵進行，酒醅中的微生物區系此消彼長，各種物質形態不斷地產生和消失，通過復雜的物質能量代謝變化，生成了醇、醛、酸、酯等多種香味物質，進而形成了白酒特有的風味特征[1]。在成品白酒中，乙醇和水占其總質量的98%以上，這些香味物質所占比例不足2%，但它們的含量及比例卻決定著白酒的風格、品質。

有機酸是白酒重要的呈味物質，能起到呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用，其含量高低及相互比例直接影響著白酒的風味和質量[2-5]。清香型白酒總酸含量一般在0.3～1.4g/L之間。酸量過少，則酒味寡淡，香弱味短；酸量過大，則酸味露頭，酒味粗糙。汾酒的主體呈味酸類物質是乙酸和乳酸，兩者占滴定總酸的99%以上，其中乙酸占滴定總酸的72%～82%；乙酸與乳酸的質量比在2.64～3.94之間，平均比值在3.3左右[2]。乙酸酸味刺激性強，適量能使白酒有爽快感，含量過高則呈刺激感；乳酸酸中帶澀，適量能增加白酒的醇厚性，過多則呈澀味；丁酸有汗臭味，且對于清香型白酒來說就偏型了；己酸較丁酸柔和，但也有汗臭味等。有機酸作為相應酯類的前體物質，其含量及比例在很大程度上影響著相應酯類的量比關系。有機酸的含量直接決定著酒醅的酸度，從而在很大程度上影響著酒醅中微生物的生長代謝，進而影響到醇類、羰基化合物等的含量及比例。酸度過大是固態發酵夏季掉排、出酒率降低的重要原因[6]。因此，有機酸在發酵過程中的生成量及其相互間的量比關系，在很大程度上制約著酒醅發酵的好壞，進而影響白酒的品質。本實驗采用60%乙醇提取酒醅中的有機酸，進行衍生化處理后，利用氣相色譜-質譜聯用和氣相色譜衍生化法[7-15]進行定性、定量分析，跟蹤考查汾酒發酵過程中有機酸隨發酵時間的變化規律，同時利用酸度計測定法和酸堿中和法分別測定不同發酵時期酒醅的pH值和酸度，旨在為指導白酒生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集山西杏花村汾酒廠股份有限公司夏季正常大茬發酵地缸中距離表層30cm處不同發酵時期的酒醅，冷凍保藏備用；采樣根據入缸發酵時間不同分別選取0、3、5、7、9、11、15、21、28、40d。

α-乙基正丁酸(內標，色譜純) 北京化學試劑公司；10%四丁基-氫氧化銨水溶液(分析純) 上?；瘜W試劑有限公司；N,N-二甲基乙酰胺、溴乙烷(分析純)成都市科龍化工試劑廠；無水乙醇(分析純) 北京華騰化工有限公司。

1.2 儀器與設備

GC7890-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀(配有Dean Switch裝置) 美國Agilent公司；GC-2010型氣相色譜儀 日本Shimadzu公司；PHS-4CT型臺式精密pH計上?？祪x儀器有限公司；BS124S型電子天平 德國Sartorius公司；SZCL型數顯智能控溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；KQ3200DA型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中有機酸的提取

分別準確稱取各時期酒醅樣品10.0g置于100mL小燒杯中，加入60%的乙醇水溶液30mL，攪拌均勻后超聲波輔助提取30min，轉移至離心管中，5000r/min離心10min，取上清液，得酒醅有機酸提取液。

1.3.2 相關溶液的配制

內標液的配制：準確稱取質量分數為99%的α-乙基正丁酸0.0487g置于10mL容量瓶中，用60%的乙醇定容，搖勻備用。

0.1 mol/L四丁基-氫氧化銨水溶液的配制：準確吸取質量分數為10%的四丁基-氫氧化銨水溶液12.974mL置于50mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻備用。

1.3.3 分析樣品的制備[7-8]

準確稱取不同發酵時期的酒醅有機酸提取液各一半，加入0.3mL按1.3.2節方法配制的α-乙基正丁酸內標液，用0.1mol/L四丁基-氫氧化銨水溶液中和至pH9.0，于沸水浴上蒸干；冷卻后用5mL N,N-二甲基乙酰胺溶液分3次溶解剩余殘渣，把溶液合并于一支具塞比色管中；用移液槍準確加入2倍中和時所消耗四丁基-氫氧化銨物質的量的溴乙烷，塞緊，搖勻；在室溫下靜置反應1h，取上清液1μL進行氣相色譜-質譜分析。

1.4 色譜分析檢測條件

1.4.1 氣相色譜分析條件

色譜柱：SGE BP-21 FFAP柱(25m×0.32mm，0.25μm)；升溫程序：45℃保持4min，以3.5℃/min升至230℃，保持20min；FID檢測器與氣化室溫度均為250℃；載氣(N2)流速1.0mL/min，氫氣流速47.0mL/min，空氣流速400.0mL/min；柱前壓29.4kPa；進樣量1μL，分流比45:1。

1.4.2 氣相色譜-質譜分析條件

電子轟擊(EI)離子源，電子能量70eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度280℃，四極桿溫度150℃，質量掃描范圍m/z 29～400。色譜柱：J&W HP-FFAP(30m× 0.25mm，0.25μm)；載氣為氦氣。升溫程序、色譜條件同1.4.1節分析條件。

1.4.3 總酸度和pH值的測定

樣品預處理：準確稱取10.0g酒醅于250mL燒杯中，加入100mL煮沸冷卻的蒸餾水攪拌10min，超聲波處理15min后，5000r/min離心10min，取上清液于容量瓶中備用。

總酸度的測定[7]：準確吸取10mL上清液于錐形瓶中，加入20mL煮沸冷卻的蒸餾水和2滴酚酞試劑，用0.1mol/L NaOH溶液滴定至微紅色，10s不退色，記錄消耗NaOH溶液的體積，平行滴定3次，取其平均值?？偹岫榷x[7]：100g酒醅滴定消耗氫氧化鈉的毫摩爾數，以度表示。

pH值的測定：準確吸取20mL備用上清液于小燒杯中，用精密pH計測定。

2 結果與分析

2.1 酒醅中有機酸含量隨發酵時間的變化規律

采用1.3.1節方法提取酒醅中的有機酸，衍生化處理后經氣相色譜-質譜定性和氣相色譜定量分析，考察汾酒發酵過程中有機酸含量的變化情況。上述方法不但排除了醇類、酯類等揮發性物質的干擾，而且能同時定量檢測多種有機酸，特別是解決了直接進樣法中甲酸在FID檢測器上響應信號極小以及乳酸由于極性強在一般毛細管柱上不出峰的難題；與其他衍生化法相比該方法所用試劑溴乙烷更加安全，重氮甲烷酯化法所用重氮甲烷等試劑有劇毒，易爆，芐酯化法所用芐基溴是毒性催淚試劑[7]；此外，該方法簡單、準確、重現性好，可滿足白酒及發酵酒醅中有機酸含量的定量檢測，便于工廠推廣應用。不同發酵時期酒醅中有機酸的定性、定量分析結果如表1所示。

表1 汾酒發酵酒醅中有機酸成分的分析測定結果Table 1 Variation of organic acids in fermented grains during Fen liquor fermentation mg/g

由表1可見，汾酒大茬發酵過程中所檢測的10種有機酸中，乳酸含量最高，在發酵后期達到了20mg/g左右，乙酸含量次之，在發酵后期達到了1.7mg/g左右，此時乳酸含量為乙酸含量的10倍以上。而在成品汾酒中，乙酸的含量要高于乳酸，這與它們自身的性質及固態發酵白酒特殊的蒸餾取酒方式有關，雖然在甑桶蒸餾過程中各有機酸的含量隨蒸餾時間的延長總趨勢是由少到多，但由于乙酸的揮發性很強而乳酸的揮發性相對較弱等原因使得流酒斷花前乙酸的餾出量大于乳酸的餾出量。庚酸、辛酸、壬酸和癸酸在酒醅中都有檢出，有些含量也并不太低，但在成品白酒中卻含量極微，這主要是由于它們的沸點太高，達220℃以上的緣故。由于己酸的衍生化產物己酸乙酯與衍生化過程中所產生的四丁基溴化銨的峰重合未能定量檢出。

乳酸的含量在0～21d內隨發酵進行整體上呈快速增長趨勢，9～11d有所下降，在第21天達到最大值23.6151mg/g，在21～40d內含量有所下降，但基本維持在20mg/g左右。甲酸的生成趨勢與乳酸基本一致。乙酸的含量隨發酵進行呈增長趨勢，發酵前期增長較為緩慢，發酵中后期增長迅猛，在傳統發酵結束(28d)后其含量達到1.7mg/g左右。丁酸以0.0457mg/g的含量入缸，在發酵第一周內含量變化不大，7～9d含量大幅度增長，9～11d有所下降，11～15d又大幅增長并達到最大值0.9670mg/g，此后隨發酵進行呈下降趨勢。壬酸和癸酸的生成趨勢大體一致：0～9d含量快速上升，9～11d含量有所下降，11～15d含量又快速上升，此后隨發酵進行含量逐漸下降。戊酸、異戊酸、庚酸和辛酸的變化趨勢基本一致：0～7d含量大幅增長，7～11d含量大幅度下降，11～21d含量又快速增長，此后隨發酵進行含量有所下降。

實驗結果顯示，大多數有機酸的含量在9～11d(有些為7～11d)呈下降趨勢，這可能是因為此時微生物大量繁殖且生命活動旺盛所需碳源和能源物質供應不足，導致有機酸被消耗利用的緣故[16]；多數有機酸在發酵21d后含量呈下降趨勢，可能與發酵后期酯化作用較強有關，這一現象有待進一步研究。

2.2 總酸度和pH值隨發酵時間的變化規律

總酸度是指酒醅中所有酸性成分的總量，包括未解離酸的濃度和已解離酸的濃度；pH值反應的是酒醅的有效酸度，即酒醅中H+的活度[17](一般用濃度代替)。它們是非常重要的發酵參數，不僅在一定程度上反應了酒醅中微生物的生長代謝情況，而且影響著微生物的生長及代謝產物的形成[16]。因此，考查酒醅發酵過程中總酸和pH值的變化，對于了解酒醅中微生物的生長代謝、判斷酒醅發酵好壞、指導白酒生產具有重要意義。不同發酵時期酒醅總酸度和pH值的測定結果如表2所示。

表2 不同發酵時期酒醅總酸度和pH值的測定結果Table 2 Variation of total acidity and pH value of fermented grains Fen liquor fermentation

由表2可見，隨著發酵進行酒醅總酸度呈快速上升趨勢，9～11d略有下降，可能是因為此時微生物大量繁殖所需能源和碳源物質不足，導致有機酸被消耗利用的緣故。酒醅入缸時總酸度為5.40，28d發酵結束時上升到30.67，在延長發酵期內持續上升，40d時達到32.50；相應地，pH值從入缸時的4.35下降到28d發酵結束時的3.37，在延長發酵期內持續下降，40d時下降到3.26。

酒醅的有效酸度與總酸度的變化趨勢大體一致，但并不完全相同。在0～3d酒醅總酸度上升，pH值不但沒有下降反而略有上升，15～21d酒醅總酸上升了約7度，但pH值基本沒有變化。這是由于pH值的大小不僅取決于總酸中酸的性質與數量，而且還受所測樣品中緩沖物質量及其緩沖能力大小的影響，由此可見pH值與其總酸度之間并沒有嚴格的比例關系[17]。

在分析酒醅中有機酸隨發酵時間變化規律的同時分析了其他香味成分隨發酵時間的變化規律[18]，研究發現：1)酒醅中大多數醇類及酯類的變化趨勢大體一致：發酵前期(0～7d或9d)含量快速上升，發酵中期(9～15d或21d)含量基本保持穩定，發酵后期含量又有所增長；2)大多數化合物在9d左右時的含量與其在21～28d時的含量相當；3)乳酸乙酯的含量隨發酵進行持續而快速的增長，乙酸乙酯的含量在9d以后增加幅度很小，在發酵后期乳酸乙酯的含量約為乙酸乙酯的4～5倍；4)酒醅總酸度、有效酸度、乙酸和乳酸含量隨發酵進行持續增長，發酵后期乳酸含量為乙酸含量的10倍以上。由于白酒的品質取決于其中各香味成分的含量及量比關系，清香型白酒的特征香味成分乙酸乙酯與乳酸乙酯的質量比一般在1.4～1.8，其主體呈味酸類乙酸和乳酸的質量比一般在2.64～3.94之間較為適宜[2]，因此綜合考慮各種香味成分隨發酵時間的變化規律及其對發酵過程和白酒品質的影響，在汾酒夏季生產過程中，若將大茬發酵時間縮短到9d左右，并相應增加發酵輪次，有望在保證汾酒品質和產量的前提下解決酸敗問題。

3 結 論

3.1 酒醅總酸度隨發酵進行整體上呈快速上升趨勢，9～11d略有下降。發酵結束后酒醅pH值下降至3.3左右，總酸度升高了約25度。

3.2 酒醅中有機酸以乳酸含量最高，乙酸次之，在發酵后期乳酸含量為同時期乙酸含量的10倍以上，這與成品汾酒中含量相比有較大差異，成品汾酒中乙酸含量要高于乳酸，乙酸與乳酸的質量比一般在2.64～3.94之間。

3.3 汾酒夏季大茬發酵時間縮短為9d左右，并相應增加發酵輪次，用以解決酸敗問題的理論設想是否可行，下一步需要在實際生產中驗證。

3.4 綜合考察酒醅發酵過程中各種香味成分的變化規律，同時研究相應微生物的生理生化特性，結合現代生物技術，是解決酸敗問題、縮短發酵時間、提高白酒品質的有效途徑。

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Variation of Organic Acids in Fermented Grains during Fermentation of Fen Liquor

CAO Yun-gang1，MA Li1，DU Xiao-wei2，ZHANG Sheng-wan1,*
(1. School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. Shanxi Xinghuacun Fen Wine Factory Co. Ltd., Fenyang 032205, China)

The dynamic variation of organic acids in fermented grains during the fermentation of Fen liquor was monitored by derivatization followed by GC and GC-MS, together with that of pH measured using a pH meter and total acidity determined by acid-base neutralization titration. The results showed that total acidity of fermented grains generally displayed a rapid upward trend in the fermentation process except for a slight decline during days 9-11. pH of fermented grains was decreased to around 3.3 and total acidity was increased by 25 degrees after the fermentation. Among the identified organic acids in fermented grains, lactic acid showed the highest content and was dominant, followed by acetic acid, and both of them revealed a tendency to generally ascend in the whole fermentation process and their contents were over 10 times higher than that of acetic acid of the same time points at the late fermentation stage. The contents of the same organic acids in fermented grains and finished liquor were different. Based on this study, we posed a theoretical hypothesis that large-batch fermentation period in summer should be approximately 9 days and the number of fermentation batches should be increased, which is conducive to solving the spoilage problem and shortening fermentation period.

fermented grains；organic acid；derivatization；gas chromatography；gas chromatography-mass spectrometry；total acidity

TS262.3

A

1002-6630(2011)07-0229-04

2010-06-23

山西省回國留學人員科研項目(200902)；山西省科技創新計劃項目(2007101016)

曹云剛(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品化學。E-mail：200823104001@mail.sxu.cn

*通信作者：張生萬(1955—)，男，教授，學士，研究方向為食品科學、化學計量學、藥物合成。E-mail：zswan@sxu.edu.cn