植物乳桿菌發酵培養基的優化及其高密度培養技術

熊 濤，黃錦卿，宋蘇華，關倩倩，謝明勇

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

植物乳桿菌發酵培養基的優化及其高密度培養技術

熊 濤，黃錦卿，宋蘇華，關倩倩，謝明勇

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

應用響應面法優化植物乳桿菌培養基配方以及利用中和法與指數流加法優化植物乳桿菌高密度培養的發酵條件。在單因素試驗基礎上，進一步采用SAS軟件進行中心組合設計和響應面法優化發酵培養基。優化后的培養基配方為：葡萄糖質量分數5.43%、蛋白胨質量分數0.98%、K2HPO4質量分數0.59%。利用15L全自動發酵罐，在接種量3%、pH6.5、培養溫度35℃的最佳條件下，采用氨水中和發酵培養基和指數流加碳、氮源，最終發酵液中植物乳桿菌菌體濃度達到9.3×109CFU/mL。

植物乳桿菌；響應面；培養基優化；高密度培養；指數流加

乳酸菌為人體益生菌[1-4]。乳酸菌發酵產品主要有酸奶、奶酪、風味泡菜及近年來研究較多的植物發酵飲料等，因其都具有一定的保健功能而受到越來越多消費者的重視和喜愛[5]。直投式發酵菌劑在蔬菜發酵工業中的應用越來越廣泛，在發酵劑的制備過程中，關鍵環節是獲得高濃度的菌體，因此，必須對乳酸菌進行高密度培養[6]。

高密度培養是一個相對的概念[7-9]，廣義的講，凡是細胞密度比較高，以至接近其理論值的培養均可稱為高密度培養。目前，國內研究者對緩沖鹽法和化學中和法應用較多，但最終獲得的菌體濃度較小，一般不超過109CFU/mL[10]，國外研究者在細胞循環培養法和透析法方面做了許多探索，Hayakawa等[11]以1.3g/(L·h)的產率和0.2m3/kg的耗水量產出了40g/L的干細胞；Suzuki[12]用陶瓷濾器獲得的最大細胞干質量濃度為141g/L，其產率約為0.8g/(L·h)，耗水量約為0.2m3/kg，用陶瓷濾器的主要缺陷是膜的堵塞，本實驗利用緩沖鹽法、化學中和法和指數流加法對植物乳桿菌進行高密度培養，通過在發酵過程中流加補料，菌體濃度在發酵終止時獲得了很大提高，對乳酸菌大規模培養以及乳酸菌發酵劑的制備具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌(L.plantarum NCU116)由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏。

1.1.2 培養基

MRS培養基(各成分含量均指質量分數)：蛋白胨1%、牛肉膏1%、葡萄糖3%、乙酸鈉0.5%、酵母膏0.5%、檸檬酸二銨0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.02%、吐溫-80 0.1%，121℃、30min滅菌[13]；平板計數培養基：葡萄糖質量分數3%的MRS固體培養基；液體種子培養基：葡萄糖質量分數4%的MRS液體培養基。

1.1.3 儀器與設備

DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱、ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器、雷磁PHS-25型數顯pH計 上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；FUS-15L發酵罐 上海國強生物設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌濃度的測定

采用菌落平板計數法[14]測定菌落數，計算發酵液中的菌濃度。

1.2.2 還原糖含量的測定

采用直接滴定法測定還原糖含量[15]。

1.2.3 種子液的制備

轉接斜面菌種于液體種子培養基中，置于36℃恒溫培養箱中培養12h。

1.2.4 發酵培養基的優化

1.2.4.1 不同碳源對植物乳桿菌高密度培養的影響

在MRS液體培養基基礎上，選擇蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖以及葡萄糖與乳糖質量比1:1的復合糖5種碳源，質量分數都為5%。按2%接種量接種種子液于發酵培養基中，初始pH6.0，培養溫度36℃，置于恒溫箱內靜置培養18h，測定培養液的菌落數。

1.2.4.2 不同氮源對植物乳桿菌高密度培養的影響

在MRS液體培養基基礎上，選擇蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉4種氮源，質量分數都為1%。按2%接種量接種種子液于發酵培養基中，初始pH6.0，培養溫度36℃，置于恒溫箱內靜置培養18h，測定培養液的菌落數。

1.2.4.3 不同緩沖鹽對植物乳桿菌高密度培養的影響

在MRS液體培養基基礎上，選擇CaCO3、K2HPO4、NaAc、KH2PO4作為緩沖鹽，質量分數都為0.5%，以不加任何緩沖鹽作為空白對照。按2%接種量接種種子液于發酵培養基中，初始pH 6.0，培養溫度36℃，置于恒溫箱內靜置培養18h，測定培養液的菌落數。

1.2.4.4 不同生長因子對植物乳桿菌高密度培養的影響

選擇玉米漿、番茄汁、VC 3種作為生長因子，質量分數都為0.5%，以不添加任何生長因子作為空白對照。按2%接種量接種種子液于發酵培養基中，初始pH 6.0，培養溫度36℃，置于恒溫箱內靜置培養18h，測定培養液的菌落數。

1.2.4.5 響應面法優化發酵培養基

選擇上述最佳碳源、氮源、緩沖鹽做響應面試驗。碳源質量分數分別選擇1%、3%、5%、7%、9%，氮源質量分數分別選擇0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，緩沖鹽質量分數分別選擇0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，采用三因素三水平，應用SAS軟件的響應面法優化培養基配方[16]。

1.2.5 植物乳桿菌高密度培養條件的優化

1.2.5.1 接種量的選擇

選擇不同接種量1%、2%、3%、5%、9%，接種種子液于發酵培養基中，初始pH6.0，培養溫度36℃，置于恒溫箱內靜置培養18h，測定培養液的菌落數。

1.2.5.2 溫度的選擇

按最佳接種量接種種子液于發酵培養基中，初始pH6.0，分別在25、30、35、40、45℃靜置培養18h，測定其菌落數。

1.2.5.3 最佳pH值的選擇

選擇pH值分別為7.5、7.0、6.5、6.0、5.0、4.0，在15L發酵罐內分批發酵，按最佳接種量接種，最佳溫度培養，攪拌速度控制在100r/min，每隔3h測定菌落數，選擇其最佳pH值。

1.2.5.4 最終生長曲線的測定

利用15L發酵罐，按得到最佳條件培養，攪拌速度100r/min，每隔3h測定菌落數和還原糖的含量。

1.2.6 高密度培養技術的研究

1.2.6.1 中和法高密度培養的研究

選擇常用的Na2CO3溶液和氨水為中和劑，利用15L全自動發酵罐，按最終確定的培養條件進行發酵并比較兩種中和劑對植物乳桿菌高密度培養的影響，以不流加中和劑作對照，中和劑的質量分數都選擇25%，每隔4h測定菌落數和還原糖含量。

1.2.6.2 流加法高密度培養的研究

利用15L發酵罐，比較恒速流加和指數流加對植物乳桿菌高密度培養的影響，以確定一種更優的流加方式。流加葡萄糖質量濃度為300g/L，每隔4h測定菌落數和還原糖的含量。

恒速流加：以恒定的流加速度200g/h流加到發酵罐內。

指數流加：以1.2.5.4節最終確定的生長曲線做參考，在菌體生長對數期開始時進行流加，并且流加速度隨著生長曲線的變化而變化，初始速度為50g/h，流加速度呈指數(2n)增加，直至對數生長末期。

1.2.6.3 中和法與流加法綜合利用的高密度培養的研究

利用發酵罐自動控制功能，實現自動流加控制，控制最佳pH值，同時流加碳、氮源，當菌體培養進行至對數期時，營養物質消耗殆盡，這時補充足夠的營養物能延續菌體的生長。培養過程中同時添加中和劑中和乳酸菌產生的乳酸，防止罐體內培養基的pH值降低。每隔4h測定菌落數及還原糖含量。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基的優化

圖1 碳源、氮源、緩沖鹽和生長因子對植物乳桿菌高密度培養的影響Fig.1 Effects of carbon source, nitrogen source, buffer salt and growth factor on high-density culture of L. plantarum

2.1.1 碳源的選擇

由圖1a可知，葡萄糖作為碳源時，菌濃度最高，最適合菌體生長，可能是因為植物乳桿菌不能利用復雜的碳水化合物，細胞內缺乏分解多糖的酶，因此多糖類物質不適合作為碳源。

2.1.2 氮源的選擇

由圖1b可知，有機氮源比無機氮源的效果更好，有機氮源直接含有植物乳桿菌生長所需的氮源如氨基酸等物質，而無機氮源需要經過合成或轉化才能得到氨基酸。由于胰蛋白胨的成本較高，所以選擇蛋白胨作為氮源。

2.1.3 緩沖鹽的選擇

由圖1c可知，K2HPO4作為緩沖鹽的效果最好，而CaCO3的效果最差，可能是因為CaCO3在水中的溶解度很低，易形成乳濁液，與乳酸不能充分接觸，也易形成空間阻隔，使菌體不能和培養基充分接觸，造成菌濃度偏低。

2.1.4 生長因子對菌濃度的影響

由圖1d可知，玉米漿、VC、番茄汁3種生長因子中番茄汁促進菌體生長的效果最佳。植物乳桿菌為生長因子異養型微生物，自身不能合成生長因子，它們的生長需要多種生長因子，如多種維生素等。

2.1.5 碳源、氮源、緩沖鹽添加水平的選擇

圖2 不同葡萄糖、蛋白胨和K2HPO4質量分數對菌濃度的影響Fig.2 Effects of glucose, peptone and K2HPO4concentrations on highdensity culture of L. plantarum

2.1.5.1 葡萄糖添加量選擇

由圖2a可以看出，葡萄糖質量分數在5%時菌濃度最高，發酵培養效果最好。

2.1.5.2 蛋白胨添加量選擇

由圖2b可以看出，當蛋白胨質量分數增加到1%時菌濃度最高，最佳氮源質量分數選擇1%。

2.1.5.3 緩沖鹽添加量選擇

由圖2c可以看出，K2HPO4質量分數為0.5%時菌濃度最高，發酵培養效果最好。

2.1.6 響應面優化試驗結果

2.1.6.1 響應面方差分析結果

通過單因素試驗并且確定重要因素最佳質量分數的取值區間，利用SAS V8.0分析軟件進行響應面試驗設計，見表 1、2。

表1 響應面試驗因素和水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Scheme and results of response surface design

對試驗結果進行方差分析，擬合得回歸方程為：Y=4.763333+0.395X1+0.0825X2+0.7075X3-1.239167X12-1.354167X22-0.904167X32-0.185X1X2+0.3X1X3-0.54X2X3。

由表3方差分析可知，X1、X12、X3、X22、X32、X2X3對響應值的影響顯著，說明葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4是植物乳桿菌NCU116發酵培養基成分的重要控制因素。失擬項P=0.6057，沒有顯著性意義。從模型可信度分析表4可見，回歸方程復相關系數R2=97.63%，說明回歸方程擬合度良好，失擬較小，可用于培養基的優化。

表3 響應面試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of the established regression equation for cell density of L. plantarum

表4 模型的可行度分析Table 4 Feasibility analysis of the established regression equation for cell density of L. plantarum

2.1.6.2 響應面優化最佳條件

根據上述回歸方程繪出響應面分析圖及等高線圖，研究葡萄糖、蛋白胨、K2HPO43個因素對發酵的影響，響應面和等高線圖見圖3～5。

圖3 Y=f(X1, X2)的響應面及其等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of Y=f(X1, X2)

圖4 Y=f(X1, X3)的響應面及其等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of Y=f(X1, X3)

圖5 Y=f(X2,X3)的響應面及其等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of Y=f(X2, X3)

從圖3～5可看出，兩兩因素之間存在比較明顯的交互作用，最佳點落在試驗考察區域內。為進一步求得最佳點值，對回歸方程分別求一階偏導數，得到最后的最佳值分別為X1=5.43%、X2=0.98%、X3=0.59%，菌體濃度4.76×109CFU/mL。

2.1.6.3 優化條件的驗證

用響應面試驗優化后的理論值做驗證實驗。以所得最佳反應條件：葡萄糖質量分數5.43%、蛋白胨質量分數0.98%、K2HPO4質量分數0.59%進行實驗，得到菌體濃度為4.68×109CFU/mL，擬合度為97.63%，表明預測值和真實值之間有很好的擬合性，進一步驗證了模型的可靠性。

2.2 植物乳桿菌高密度培養條件

圖6 接種量和培養溫度對菌濃度的影響Fig.6 Effects of inoculation amount and culture temperature on cell density of L. plantarum

2.2.1 接種量的選擇

由圖6可見，接種量在3%時，菌體生長效果最佳。接種量在9%時菌濃度偏低，接種量過高，菌體生長不好，可能是因為在發酵初始階段培養基中的營養物質不能滿足大量菌體生長的需求。

2.2.2 培養溫度的確定

由圖6可知，溫度對植物乳桿菌的影響比較明顯，在35℃時，菌體濃度達到5.4×109CFU/mL。溫度變化會直接影響菌體內蛋白質、酶的活性，溫度過高會使得細胞內蛋白質變性，影響核糖體、RNA等大分子的穩定性；溫度過低會降低酶活力，引起細胞膜流動性的變化，從而影響菌體的正常生長。

2.2.3 最佳pH值的確定

由圖7可知，在pH6.5時，菌體生長最好，而在pH4.0時，菌體生長緩慢，pH值越低，植物乳桿菌所受酸脅迫的影響越大，所以最佳pH值應該控制在6.5左右。

圖7 pH值對菌濃度的影響Fig.7 Effect of pH on cell density of L. plantarum

2.2.4 植物乳桿菌最終生長曲線

確定培養基配方和培養條件，利用15L發酵罐培養植物乳桿菌，繪制其菌濃度生長曲線以及還原糖含量曲線，結果如圖8所示。

圖8 植物乳桿菌生長曲線及還原糖含量變化Fig.8 Growth curve of L. plantarum and sugar content change

由圖8可知，得到最佳培養基條件和培養條件后，菌體的最佳收獲期是在20h左右，后續實驗以這個收獲期為收獲依據。

2.3 植物乳桿菌高密度培養技術的研究

2.3.1 中和法對高密度培養的影響

利用發酵罐，選擇氨水、Na2CO3溶液作為中和劑，并且研究兩種中和劑對發酵的影響，其生長曲線如圖9所示。

圖9 中和劑對菌濃度的影響Fig.9 Effect of neutralizer on cell density of L. plantarum

參考生長曲線圖與不添加中和劑對比，由圖9可知，流加中和劑氨水后植物乳桿菌高密度培養最高菌濃度比不添加中和劑要高，達到6.8×109CFU/mL。在植物乳桿菌的培養過程中，由于其代謝物質會對菌體的繁殖產生抑制作用，pH值降低，從而影響菌體繼續繁殖。植物乳桿菌在高密度培養過程中產生的酸量較大，使得植物乳桿菌的耐受性不能降低酸對菌體產生的脅迫效應。在培養過程中加入中和劑，使培養過程的pH值保持穩定，可以去除酸脅迫。

2.3.2 流加方式對高密度培養的影響

圖10 流加方式對菌濃度和還原糖含量的影響Fig.10 Effect of feeding batch mode on cell density of L. plantarum and reducing sugar content

由圖10可知，指數流加培養的效果最佳，菌濃度能達到6.6×109CFU/mL，而恒速流加能達到5.5× 109CFU/mL，兩種流加培養方式的菌濃度都高于非流加培養。

在高密度培養早期，細胞濃度較低，流加速率必須控制在較低水平，葡萄糖過量會影響植物乳桿菌發酵，而隨著細胞的生長，碳源和氮源不斷被大量消耗，菌體生長速率也隨之降低。指數流加是根據菌體的生長曲線以及還原糖含量進行流加，其流加速率與生長曲線和還原糖含量同步，在指數生長區間進行流加；而恒速流加只是在發酵初期能滿足細菌對營養物質的要求，隨著細胞生長，碳、氮源消耗過快，則不能滿足菌體對營養物質的需求。綜上所述，本實驗選擇指數流加方法對植物乳桿菌進行高密度培養。

2.3.3 中和法和指數流加法綜合利用對高密度培養的影響

圖11 中和法和指數流加綜合利用的菌體生長曲線和還原糖含量變化Fig.11 Combined effect of neutralization and exponential feeding method on cell density of L. plantarum and reducing sugar content

如圖11所示，中和法與指數流加法綜合應用于植物乳桿菌高密度培養時效果明顯，可以提高菌體的生長速率，最終菌濃度達到9.3×109CFU/mL。中和法和指數流加法相結合的綜合利用不僅能消除乳酸對菌體的酸脅迫效應，還能滿足菌體在對數生長期大量營養物的需求。

3 結 論

以植物乳桿菌NCU116為實驗菌種進行高密度培養，經過單因素試驗以及響應面試驗設計分析，最終得到發酵培養基的配方為葡萄糖質量分數5.43%、蛋白胨質量分數0.98%、K2HPO4質量分數0.59%，在接種量為3%、培養溫度35℃、pH6.5，中和法和指數流加綜合利用，培養結束后最終菌濃度達到9.3×109CFU/mL。

[1] 張剛. 乳酸細菌: 基礎、技術和應用[M]. 北京: 化學工業出版社, 2007: 212- 266.

[2] GARDNER N J, SAVARD T, OBERMEIER P, et al. Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fermentation of carrot, cabbage, beet and onion vegetable mixtures[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 64(3): 261-275.

[3] 吳祖芳, 劉璞, 翁佩芳. 榨菜加工中乳酸菌技術的應用及研究進展[J]. 食品與發酵工業, 2005, 31(8): 73-76.

[4] 吳祖芳, 劉璞, 翁佩芳. 傳統榨菜腌制加工應用乳酸菌技術的研究[J]. 食品工業科技, 2008(2): 101-103.

[5] 申彤, 徐靜. 植物原料乳酸菌發酵劑增菌培養的研究[J]. 食品科技, 2006(9): 47- 49.

[6] PEEBLES M M, GILLILAVD S E, SPECK M L. Preparation of concentrated lactic streptococcus starters[J]. Appl Microbiol, 1969, 17(1): 805-810.

[7] 張安平. 重組大腸桿菌培養條件的優化及其高密度發酵的初步研究[D]. 北京: 中國科學院化工冶金研究所, 1996.

[8] 陳洪章, 李佐虎. 酵母菌的高密度發酵[J]. 工業微生物, 1998, 28(1): 28-31.

[9] 李民, 陳常慶. 重組大腸桿菌高密度發酵研究進展[J]. 生物工程進展, 2000, 20(2): 26-30.

[10] 靳志強, 李平蘭. 補料分批法高密度培養德氏乳桿菌保加利亞亞種S-1[J]. 中國乳品工業, 2007, 35(1): 4-9.

[11] HAYAKAWA K, SANSAWA H, NAGUMEME T. High density culture of Lactobacillus casei by cross flow culture flow culture method based on kinetic properties of the micorganism[J]. Ferment Bioeng, 1990, 70 (1): 404-405.

[12] SUZUKI T. A dense cell culture system for microorganisms using a stirred ceramic filters[J]. Ferment Bioeng, 1996, 82(1): 264-271.

[13] 熊澤, 仇敏, 邵偉, 等. 瑞士乳桿菌凍干發酵劑制備中保護劑的選擇[J]. 冷飲與速凍食品工業, 2006, 12(3): 20-21; 24.

[14] 張艷, 劉均娥, 張晶, 等. 平板活菌計數法檢測糞便中的腸道菌群[J].首都醫科大學學報, 2008, 29(1): 85-86.

[15] 中國國家標準化管理委員會. GB/T 5009.7—2008 食品中還原糖的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[16] SOLIMAN N A, BEREKAA M M, ABDEL-FATTAH Y R. Polyglutamic acid (PGA) production by Bacillus sp. SAB- 26: Application of Plackett-Burman experimental design to evaluate culture requirements[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69(1): 259-267.

Lactobacillus plantarum: Optimization of Fermentation Medium and Investigation of High-density Culture Methods

XIONG Tao，HUANG Jin-qing，SONG Su-hua，GUAN Qian-qian，XIE Ming-yong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In this study, response surface methodology was applied to optimize medium composition for Lactobacillus plantarum, and high-density cultivation of L. plantarum was optimized by neutralization and exponential feeding method. On the basis of single-factor experiments, the optimal fermentation medium formula was determined by central composite design combined with response surface methodology to be made up of 5.43% glucose, 0.98% peptone and 0.59% K2HPO4. Ammonia neutralization and exponential feeding carbon and nitrogen sources together operated in a 15 L fermenter under the optimal conditions (inoculation amount of 3%, pH 6.5 and cultivation temperature of 35 ℃) resulted in a final cell concentration of up to 9.3×109CFU/mL.

L. plantarum；response surface；medium optimization；high-density culture；exponential feeding batch

TS201.3

A

1002-6630(2011)07-0262-07

2010-07-26

教育部留學回國人員創業基金項目；江西省青年科學家(井岡之星)培養項目(2009年135號)

熊濤(1970—)，男，教授，博士研究生，研究方向為細胞工程和酶工程。E-mail：xt-ncu@hotmail.com