藥食兩用類食品中赭曲霉毒素A的高效液相色譜-熒光檢測方法

傅武勝，邱文倩，鄭奎城，呂華東，郭 斌，嚴小波

(1.福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350001；2.福建醫科大學 福建省疾病預防控制中心教學基地，福建 福州350001；3.福建中醫藥大學，福建 福州 350001；4.福州大學化學化工學院，福建 福州 350001)

藥食兩用類食品中赭曲霉毒素A的高效液相色譜-熒光檢測方法

傅武勝1,2，邱文倩1，鄭奎城1，呂華東1，郭 斌3，嚴小波4

(1.福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350001；2.福建醫科大學 福建省疾病預防控制中心教學基地，福建 福州350001；3.福建中醫藥大學，福建 福州 350001；4.福州大學化學化工學院，福建 福州 350001)

目的：采用免疫親和凈化和高效液相色譜技術，建立淀粉、糖類藥食兩用食品中赭曲霉毒素A的測定方法。方法：樣品粉末經甲醇-水(8∶2，V/V)渦旋、超聲及振搖提取，提取液以磷酸鹽緩沖液稀釋后，用商品免疫親和柱凈化，含有赭曲霉毒素A的甲醇洗脫液用高效液相色譜技術分析，C18反相色譜柱分離，熒光檢測器測定。結果：赭曲霉毒素A的最低檢出濃度為1.0μg/kg(RSN＝3)；在0.5～100ng/mL范圍內，峰面積與質量濃度呈線性關系(r=0.9995)；以不含赭曲霉毒素A的太子參、蓮子、薏苡、麥冬和龍眼肉為加標基質，加標水平為1～8μg/kg時，平均回收率在81.8%～107%之間，RSD為1.66%～15.0%(n＝3)。結論：免疫親和柱能和高效液相色譜-熒光檢測相結合取得較為滿意的結果，準確度高、精密度好，滿足歐盟對食品飼料中OTA檢測方法的要求，適合于淀粉、糖類藥食兩用食品中赭曲霉毒素A的測定。

藥食兩用食品；赭曲霉毒素A；免疫親和凈化；高效液相色譜法

赭曲霉毒素(ochratoxins)是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產生的一種具有致癌、致畸、免疫抑制和肝腎毒性的有機酸類真菌毒素，有A、B、C、D四種化合物[1]，國際上較為關注的是赭曲霉毒素A(OTA)，其在霉變谷物、飼料中較為常見。WHO/FAO食品添加劑和污染物聯合專家委員會制定了OTA的暫定每周最大耐受劑量[2]，歐盟評估了人群膳食暴露水平[3]。國際食品法典已制定了食品中OTA的限量和良好操作規范[2]，以降低OTA的健康危害。我國規定谷類和豆類OTA的限量為5μg/kg[4]，歐盟對OTA的控制更為嚴格、具體[3]，2010年歐盟增加了香辛調味料和甘草中OTA的限量，分別不能超過15～30μg/kg和20μg/kg[5]。甘草、橙花、咖啡、茶藨子、酸橙花、黑胡椒、胡荽、姜黃、干姜和人參等植物和/或芳香調味料OTA的污染較為普遍[6-10]，有些，如甘草污染水平較高，50%的樣品含量超過5.3μg/kg[9-10]。含甘草提取物的食品也檢出0.34～2.96μg/kg的OTA，兒童每周由此攝入的OTA相當于PTWI的8.94%[11]。

香辛調味料、植物藥中OTA的檢測方法有薄層色譜法[12]、酶聯免疫吸附法[8,13]、熒光光度法[14]、高效液相色譜法[10,15-17]和液相色譜/質譜法[10,14]等。薄層色譜法法為半定量方法，靈敏度較低，重復性差，如未經過充分凈化，雜質干擾比較嚴重。ELISA法被用于初篩，成本低，但用于檢測中樣品時假陽性率較高。液相色譜/質譜法是一種確證性方法，檢出限低至0.3μg/kg，但儀器也十分昂貴，分析成本高。高效液相色譜法結合熒光檢測器，靈敏度較高，定量結果準確。生物樣品中OTA含量低(μg/kg級)，基體復雜，干擾較多，因此IAC(immunoaffinity column)凈化效果更好。雖有免疫親合柱上顯色快速篩查法[18]用于色素含量較高的甘草、姜、肉豆蔻、黑胡椒、白胡椒和辣椒，以及IAC-TLC法[12]用于測定綠咖啡中OTA測定的報道，但應用最普遍、效果最好的還是IAC-HPLC法，已經有較為成熟的商品IAC柱出售，國外有用于植物藥的報道[10,17]。此外，也有商品多功能親和柱，可用于同時凈化、檢測人參、干姜和松果菊中的OTA和黃曲霉毒素[7,16]。國內應用該法于香辛料和藤蔓水果干中OTA的檢測[14]，但未見用于藥食兩用類食品樣品。因此本實驗從福建省主產的淀粉或糖含量較高的6種藥食兩用食品入手，發展基于IAC凈化的HPLC-熒光檢測器檢測技術，為開展污染調查提供良好的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太子參、蓮子、薏苡、澤瀉、麥冬、龍眼干樣品在2009年6月至2010年3月間，購于福州市各大連鎖藥店、超市和福建省部分產地，樣品經福建中醫藥大學藥學院吳錦忠教授鑒定為太子參(Pseudostellaria heterophylla (M iq.) Pax ex Pax et Hoffm)、澤瀉(Alisma orientale (Sam.) Juz.[A.plantago-aquatica L.var. orientale Sam.])、蓮子(Nelumbo Nucifera Gaertn.)、薏苡(Coiχ lacroyma-jobi L. var. ma-yuen (Roman.) Stapf)、麥冬(Ophiopogonjaponicus (Thunb.) Ker-Gawl.)、龍眼肉(Euphoria longan (Lour.) Steud.)。樣品處理方法：用高速粉碎機粉碎1～2min，每份樣品粉碎完后，去除參與粉末，再用75%乙醇清洗和消毒粉碎機腔體和機蓋；用電吹風吹干表面后，再粉碎下一個樣品；樣品粉末冷卻至室溫后，裝入密封袋中于冰箱冷藏。

免疫親和柱為德國LC Tech公司的OtaCLEANTM(3mL/支)和美國Vicam公司的Afla TestR-P(1mL/支)、50mL聚丙烯塑料離心管(美國Corning公司)、0.45μm水系微孔濾膜(直徑50mm)、玻璃微纖維濾紙(直徑110mm)。

甲醇(色譜純) 美國Fisher公司；冰乙酸、乙醇(均為優級純)；氯化鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀(均為分析純)；赭曲霉毒素A標準液(OTA，50μg/mL) 美國Supelco公司。

OTA標準儲備液(10μg/mL)的配制：移取OTA標準液(50μg/mL)，移入10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，渦旋混勻，-20℃放置備用，進一步配制為100ng/mL的標準使用液。磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)的配制：稱取10.03g Na2HPO4溶于140mL超純水中，再稱取1.932g KH2PO4溶于70mL超純水中，將兩種溶液混合后加入8.5g NaCl，充分溶解混勻，得到母液，母液稀釋5倍后供使用。

1.2 儀器與設備

LC-20AD型高效液相色譜儀(配RF-10AXL熒光檢測器) 日本Shimadzu公司；DFY-80型搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；CP225D型電子天平(感量0.1mg) 瑞士Sartorius公司；YP202N型電子天平(感量0.01g) 上海精密科學儀器有限公司；G-560E漩渦混合器 美國Scientific Industries公司；18型高速離心機、Allegra 25R型臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司；溶劑抽濾裝置 河北津騰公司；KQ-500B型、KQ3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；固相萃取裝置 美國Phenomenex公司；振蕩器 美國IKA公司；精密移液槍(100、200、1000μL)美國Gilson公司；5mL移液槍 上海大龍公司；超純水機 北京歷元電子儀器公司。

1.3 標準曲線的建立

1.3.1 標準曲線繪制

準確移取適量OTA標準使用液(100ng/mL)，加入甲醇，渦旋30s，配成質量濃度為0.500、1.250、2.500、5.000、10.000ng/mL的標準系列，進行HPLC分析。以峰面積(Y)對OTA的濃度(X，ng/mL)以最小二乘法作線性回歸，得到標準曲線。

1.3.2 液相色譜分析條件

采用自動進樣方式，將適宜濃度的OTA溶液注入高效液相色譜儀。色譜條件如下：色譜柱：Shiseido C18柱(4.6mm×150mm，3μm)；柱溫：35℃；流動相：甲醇-2%冰乙酸(65∶35，V/V)；流速：0.8mL/min；熒光檢測器：激發波長(λex)為333nm，發射波長為(λem) 447nm；進樣量：20μL。

1.4 樣品制備和OTA測定

1.4.1 樣品的提取和凈化

提取：準確稱取5.0g樣品粉末于50mL塑料離心管中，加入1g NaCl和20mL 80%甲醇，渦旋5s，使充分分散于溶劑中，超聲30min，再以300r/min的速度振蕩30min。結束后，以5000r/min速度離心10min，準確移取2.0mL上清液加入磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至25mL，充分搖勻，用玻璃微纖維濾紙過濾，收集濾液。

IAC凈化：取上述濾液10mL加到預先平衡至室溫的IAC柱，調節流速，使不超過1.0mL/min。待流干后，先用10mL PBS(pH7.2)淋洗，后用10mL超純水淋洗。淋洗結束后，用吸耳球把柱內殘余溶液盡可能擠掉，再用1.5mL甲醇分兩次充分洗脫，用2.0mL塑料離心管收集洗脫液。洗脫液充分渦旋混勻后12000r/min離心3min，輕輕倒出上層液體于進樣瓶中，供HPLC分析，外標法定量。進行空白實驗時，取5mL純水代替粉末樣品，其余步驟相同。

1.4.2 樣品溶液的測定

HPLC分析條件同1.3.2節。如所測溶液濃度超過標準曲線的線性范圍，應將樣品溶液稀釋后再行測定。如超過IAC柱的最大親和容量，則應降低取樣量或者擴大稀釋倍數后，重新用IAC制備樣品溶液，再進行HPLC測定。

1.5 結果的計算

外標法定量，以保留時間定性，峰面積定量，則樣品中OTA的濃度X/(μg/kg)為：

式中：C為待測溶液中OTA的質量濃度/(ng/mL)；F為稀釋倍數(F=25)；m為稱樣質量/g。

2 結果與分析

2.1 液相色譜和樣品凈化條件的優化

2.1.1 OTA測定條件

[1]的方法，采用的流動相為甲醇-2%冰乙酸(65∶35，V/V)，激發波長(λem)為333nm，發射波長(λem)=447nm，以Shiseido C18柱反相色譜柱作為分離柱，所得OTA色譜峰形對稱，基線平穩(圖1)；經IAC柱凈化的樣品在此條件下，也得到較為理想的色譜峰。對HPLC儀器重復性進行了考察，對質量濃度10ng/mL的OTA溶液連續重復進樣6次，所得峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.748%，說明儀器性能穩定，自動進樣的精密度高。

圖1 標準溶液(A)和太子參樣品(B)中OTA的色譜圖Fig.1 Chromatograms of OTA in standard solution and in prince ginseng root extract

2.1.2 OTA的穩定性(再現性)實驗

取同一OTA標準液系列，連續進樣6d。OTA的日間RSD在1.70%～5.16%之間(表1)，這說明儀器的再現性較好，也說明OTA化學性質較為穩定，可放置至少6d。

表1 OTA溶液的穩定性(再現性)實驗Table 1 Stability evaluation of OTA solution during 6-day storage

2.1.3 樣品凈化條件的優化

2.1.3.1 親和速度(流速)的優化

IAC柱裝填有能與OTA特異性結合的抗體材料，這種特異性免疫親和作用通常需要保持一定的時間，因此親和過程中待測溶液流經IAC柱的速度可能影響到抗體對目標物OTA的親和作用。實驗比較了流速對兩個品牌IAC柱的影響。由于LC tech公司的IAC柱內徑較Vicam公司IAC柱大，容量多達3mL，因此通過固相萃取裝置的調節閥來控制流速；Vicam公司IAC柱內徑較小，流速較慢，因此采用加壓的方式來提高流速。發現流速過快(大于1mL/min)時，兩種柱的回收率為67.0%～70.9%，明顯低于較低流速(小于1mL/min)時的回收率(88.4%～95.0%)。因此在上樣時要控制流速，如果工作效率允許，盡量用較低的流速。

3.1.3.2 淋洗液對回收率的影響

不同的淋洗液對雜質的淋洗效果可能會有差異，從而影響IAC柱對OTA的特異性免疫親和，同時也可能由于淋洗不充分而導致檢測時有雜質干擾。比較純水(10＋10)mL、PBS緩沖液(10＋10)mL、PBS 10mL＋純水10mL三種淋洗液對麥冬和龍眼肉中OTA測定的影響。結果發現，淋洗液對OTA的回收率無明顯影響，回收率在85.5%～95.0%之間(表2)。考慮到基質的復雜多樣，為保證有較好的淋洗效果，保護抗體的穩定性，又減少緩沖液中鹽類進入色譜柱，通常緩沖液對抗體的保護能力更強，實驗選擇了PBS 10mL＋純水10mL這種3種淋洗方式。

2.2 方法學指標的考察

2.2.1 最低檢出限

表2 淋洗液對樣品OTA回收率的影響Table 2 Effect of selected eluents on recovery rate of OTA

將0.5ng/mL的標準溶液(OTA)稀釋后再進樣，得到信噪比為3時的OTA溶液濃度為0.20ng/mL。以5g樣品計算，按照前述的稀釋步驟，計算最低檢出限為1.0μg/kg，滿足了樣品中OTA檢測和污染控制的要求。

2.2.2 線性范圍

在0.5～100ng/mL范圍內，峰面積Y與OTA濃度X/ (ng/mL)呈線性關系，得到回歸方程Y=9946.5X-8664.2，相關系數r=0.9995。在實際樣品檢測時，考慮到OTA標準液較為昂貴，同時減少操作中OTA的職業暴露風險，采用了0.5～10ng/mL的標準系列，折算為實際樣品含量，相當于2.5～50μg/kg，完全滿足日常檢測的要求。

2.2.3 準確度

選擇不含OTA的6種淀粉糖類藥食兩種食品樣品(太子參、蓮子、薏苡、澤瀉、麥冬和龍眼)，以此作為加標基質，加入不同體積的OTA(C=100ng/mL)標準溶液，使加標水平在1～8μg/kg之間，放置30min后，進行不同水平的加標回收率實驗，每個水平重復實驗3次，按照1.4節的樣品制備和測定方法進行操作，結果見表3。在此水平下，除了澤瀉4.0μg/kg加標水平回收率略高(116%)外，其余各類基質中OTA的平均回收率均在81.8%～107%之間，較為理想，滿足歐盟對食品中OTA檢測的質量控制要求[19](1～10μg/kg時，回收率在70%～110%)，說明所用的兩種商品IAC柱性能穩定、效果較好，操作過程容易控制。

表3 某些基質中OTA的加標回收實驗結果(n＝3)Table 3 Mean recovery rates and RSDs for OTA in spiked food matrices (n＝3)

2.2.4 精密度

為進一步考察樣品制備直至HPLC分析整個過程中，OTA結果的一致性，對6種藥食兩用食品進行了重復加標實驗(n＝3)，重復實驗的RSD在1.66%～15.0%之間，精密度較為理想，優于歐盟對食品OTA檢測的室內重復性RSD控制要求[19](1～10μg/kg時，RSDr＜20%)。也說明商品OTA柱性能穩定，操作過程容易控制。

3 結 論

3.1 建立了6種淀粉糖類藥食兩用食品中赭曲霉毒素A的免疫親和凈化-液相色譜熒光檢測方法，最低檢出限為1.0μg/kg，平均回收率在81.8%～107%之間，RSD為1.66%～15.0%，各項性能指標滿足該類食品中OTA檢測和污染控制的要求。

3.2 免疫親和柱凈化效果理想，操作簡便快速，易于掌握，重復性和再現性好，值得進一步推廣用于其他品種食品和中赭曲霉毒素A的檢測。

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Determination of Ochratoxin A in Edible and Medicinal Foods by HPLC-Fluorescence Technology

FU Wu-sheng1,2，QIU Wen-qian1，ZHENG Kui-cheng1，LU Hua-dong1，GUO Bin3，YAN Xiao-bo4
(1. Fujian Center for Disease Prevention and Control, Fuzhou 350001, China；2. Teaching Base of Fujian Center for Disease Prevention and Control for Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China；3. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350001, China；4. College of Chemistry and Chemical Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350001, China)

Objective∶ To develop a method to determine ochratoxin A (OTA) in edible and medicinal foods using immunoaffinity column purification and high performance liquid chromatography (HPLC). Methods∶ Powdered samples were extracted with methanol-water (8∶2, V/V) sequentially by vortex mixing, ultrasonic treatment and shaking. The resulting extract was diluted with phosphate buffer solution, filtrated and cleaned up on immunoaffinity column (IAC) containing antibodies specific to OTA . The pooled eluate was separated on a C18 column (4.6 mm × 150 mm, 3μm) and detected by fluorescence detector (FLD). Results∶The limit of detection (LOD, RSN = 3) was 1.0μg/kg for OTA. An excellent linear relationship between peak area and OTA concentration was observed in the OTA concentration range of 0.5-100 ng/mL with correlation coefficient of 0.9995. The average recovery rates for OTA in prince ginseng root, lotus seed, coix seed, Radiχ Ophiopgonis, dried longan pulp and oriental water plantain rhizome spiked with OTA standard at a level of 1-8μg/kg were varied from 81.8%-107% with a relative standard deviation (RSD) of 1.66%-15.0% (n = 3). Conclusion∶ This method has the advantages of satisfactory results and high accuracy and precision and can meet the requirements of the Europe Union for the determination of OTA in food and feed, thus providing a suitable method for determining OTA edible and medicinal foods rich in starch or sugar.

foods；ochratoxin A；immunoaffinity cleanup；high performance liquid chromatography

O656.31

A

1002-6630(2011)14-0298-05

2010-08-19

福建省科技計劃重點項目(2008Y0029)

傅武勝(1971—)，男，副主任技師，博士，研究方向為污染物化學與風險評估。E-mail：fwsfqm@126.com