3種中草藥對克氏原螯蝦血清溶血活性、凝集活性的影響

許巧情，黃 翠(長江大學動物科學學院，湖北荊州434025）

趙朝陽，周 鑫(中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業部淡水魚類遺傳育種與養殖生物學重點開放實驗室，江蘇無錫214081）

近年來，克氏原螯蝦(Procambarusclarkii）在全國各地人工養殖方興未艾。據統計，僅湖北省荊州地區養殖克氏原螯蝦的水面就已經達到數萬公頃。但隨著人工養殖面積的迅速擴大，病害的發生也越來越頻繁和嚴重。國內已相繼報道了克氏原螯蝦的螺原體病、爛鰓病等疾病[1]，這些疾病已經給克氏原螯蝦養殖者帶來了重大經濟損失[2，3]。傳統上治療和預防克氏原螯蝦疾病主要依賴抗生素、化學藥物等，但這些藥物濫用造成的環境污染、藥物殘留、病菌的耐藥性等問題已嚴重困擾克氏原螯蝦的養殖，而提高機體免疫力是進行疾病防治的基礎，因此加強對克氏原螯蝦免疫機能的研究尤為重要。

甲殼動物機體的免疫防御功能主要依賴于血細胞的吞噬、包掩等細胞免疫反應，其體液中不具有免疫球蛋白，缺乏抗體介導的免疫反應，體液免疫主要是指血淋巴中的一些酶和調節因子，如酚氧化酶原激活系統、溶血素、凝集素、溶菌酶、蛋白酶抑制劑等。凝集素是一種能使細菌、脊椎動物的紅細胞、某些寄生蟲等發生凝集的因子，它實際上是一個蛋白質家族，具有結構異質性和異物結合位點的特異性，對熱不穩定(56℃15min即可失活），其活性需Ca2＋激活。它的作用類似于脊椎動物的抗體，是甲殼動物體內的一種免疫識別因子[4-6]。中草藥具有補充營養，提高機體的特異性和非特異性免疫力的功能；具有抗菌、抑制病毒等方面的作用[7]。目前，關于中草藥對甲殼動物凝集素的影響報道較少，而有關中草藥對克氏原螯蝦凝集素影響的研究尚未見報道。因此，通過對克氏原螯蝦血清溶血素、凝集活性的測定及進一步研究，篩選促進生長和調節克氏原螯蝦非特異性免疫功能的中草藥免疫調節劑，可進一步為克氏原螯蝦免疫應答機理研究和提高其抗病能力提供科學依據。

1 材料與方法

1．1 材料

克氏原螯蝦購于湖北省荊州市鐘鼓樓市場；陳皮、甘草、淫羊藿3種中草藥購于湖北省荊州市同濟大藥房；蝦飼料由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus）、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus）、大腸桿菌(Escherichiacoli）、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila）均由長江大學動物科學學院微生物實驗室提供。陳皮、淫羊藿和甘草的有效成分采用醇提法提取后[8]，分別添加到飼料中。

1．2 試驗方法

試驗選用同批次、健康、規格相近的克氏原螯蝦700多只，隨機分為4組，其中對照組只投喂蝦飼料原料，其余3組為試驗組，分別投喂添加了陳皮、淫羊藿、甘草的蝦飼料。每組設置9個重復，每個重復的水箱中放養20只克氏原螯蝦。試驗期間，所有試驗蝦分別養于36只完全相同的室內水箱中，室內溫度20～26℃，管理條件一致。以制備的3種中草藥添加劑飼料和飼料原料進行投喂，每天定時、定點、定量投喂。整個飼養過程中，按克氏原螯蝦常規飼養管理進行。在投喂后第7、14、21、28天分別取樣測定血清中的溶血素含量和凝集活性。

1．3 血清的制備

將克氏原螯蝦的頭胸甲打開，撥開2片鰓葉，把覆蓋在心臟上方的薄膜輕輕跳開，露出心臟，再從心臟部位抽取血淋巴，于室溫靜置2～3h，以移液槍采取血清。

1．4 雞紅細胞懸液的制備

先采集新鮮雞血，用Alsever's液保存，3000r／min離心15min后，再加0．85%滅菌生理鹽水洗滌2次以除去Alsever's液，最后用0．85%滅菌生理鹽水分別配成體積分數為3%和5%的雞紅細胞懸液，4℃冰箱保存備用。

1．5 克氏原螯蝦血清溶血活性的測定

參照文獻 [4]的方法測定。取2．5ml體積分數為3%的雞紅細胞懸液與0．1ml蝦血清混合均勻，每個樣品重復3次，25℃保溫1h。在對照管中加入2．5ml體積分數為3%的雞紅細胞懸液和0．1ml 0．85%滅菌生理鹽水，與試驗管同時保溫，取出后立即冰浴以終止反應，經1500r／min離心15min后獲得上清液。以對照管上清液作空白，于752型分光光度計540nm處測光密度。

1．6 克氏原螯蝦血清凝集紅細胞活性的測定

測定方法采用分光光度法[9]。將克氏原蝦血清按照倍比稀釋方法進行稀釋，取體積分數為5%的雞紅細胞2．5ml分別加入稀釋后的血清中。置于25℃保溫40min后，測定波長600nm處的光密度。最終血清效價為能與雞紅細胞發生明顯凝集反應的最高稀釋度的倒數，即測得吸光度越低，則凝集活性越明顯。

1．7 數據處理

試驗數據采用SPSS 15．0軟件進行方差分析，結果以平均數±標準差(mean±SD）表示。

2 結果與分析

2．1 3種中草藥對克氏原螯蝦血清溶血活性的影響

由表1可知，投喂28d后，淫羊藿組的克氏原螯蝦血清溶血活性平均值為0．806，且與對照組之間差異極顯著(P＜0．01）；而甘草組的克氏原螯蝦血清溶血活性平均值為0．527，與對照組之間差異顯著（P＜0．05）；陳皮組的克氏原螯蝦血清溶血活性平均值為0．372，與對照組之間沒有明顯的差異(P＞0．05）。

表1 投喂不同時間后各組克氏原螯蝦血清的溶血活性

2．2 3種中草藥對克氏原螯蝦血清凝集紅細胞活性的凝集效價的影響

由表2可知，投喂28d后，淫羊藿組和甘草組的凝集效價明顯高于對照組，飼喂7d后的甘草組和淫羊藿組，其凝集效價分別達到13．33和10．67，明顯高于對照組，在隨后的第14、21、28天的3次取樣中淫羊藿組和甘草組凝集活性不斷上升，淫羊藿組在第28d時達到26．67，甘草組達到53．33。統計結果表明：與對照組相比，淫羊藿組和甘草組均有顯著的提高(P＜0．05），而陳皮組差異不顯著(P＞0．05）。

表2 投喂不同時間后各組克氏原螯蝦血清凝集紅細胞活性的凝集效價

3 討論與小結

溶血素是無脊椎動物免疫防御系統中的一種重要的非特異性免疫因子，其作用類似于脊椎動物的補體系統，可以溶解異物細胞，參與調理作用。無脊椎動物的溶血素與脊椎動物血細胞表面的特異性糖鏈結合后，破裂細胞膜造成溶血現象。溶血素活性的高低反應了機體識別和排除異種細胞能力的大小。研究表明：加州美對蝦(Farfantepenaeuscaliforniensis）、日本對蝦(Marsupenaeusjaponicus）和中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis）血淋巴中存在溶血素表現出對雞紅細胞、人B型血細胞和鼠紅細胞的溶血活性。溶血活性大小與對蝦的體質有密切關系，可以用作評價對蝦健康狀況的指標[10]。日本對蝦血淋巴液對雞紅細胞具有一定的溶血作用，而瀕死對蝦的溶血活性大大降低[11]，這說明溶血素與對蝦的體質有密切關系。本試驗結果表明，連續投喂中草藥，可引起克氏原螯蝦血清中溶血活性增加，從而提高其免疫能力，這與對日本對蝦的研究一致，日本對蝦經注射蟲草多糖刺激后，溶血素活性大大增強，24h時溶血活性即比對照組高出48%，至72h時溶血活性達到最高[11]。

凝集素在無脊椎動物血液中的重要作用是起選擇凝集作用，是免疫防御的重要體液因子之一，涉及一些水生動物的幼體附著和變態行為。如多毛類動物石灰蟲(Calcarinasp．）體內產生的凝集素能識別海生假單胞菌外聚物中的葡萄糖，并與之結合，誘導石灰蟲幼體附著和變態行為[12]。到目前為止，許多甲殼動物體內已發現有凝集素的存在[4]，它們對多種脊椎動物的紅細胞均有凝集作用。其中家兔紅細胞對甲殼動物的凝集素最為敏感，斑紋蟳(Charybdiscruciata）、紅星梭子蟹(Portunussanguinolentus）、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus）、華溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense）、鋸緣青蟹（Scyllaserrata）與兔紅細胞凝集活性最強，血清凝集活力均為211[5]；南美白對蝦(Penaeusvannamei）對家兔紅細胞的凝集作用最強，凝集效價為212，其次為家鴿，為25，家雞22，對鵪鶉紅細胞的凝集活力僅為20，而對人的A、B、O血型及山羊(Caprahircus）、家鴨(Anasdomestica）、水蛇（Enhydrischinensis）、牛蛙(Ranacatesbeiana）、鯽魚(Carassiusauratus）8 種紅細胞無凝集作用[13]。

凝集素具有可誘導性，給水產無脊椎動物注入抗原或當無脊椎動物受到損傷時，其體內凝集素活性發生明顯改變。例如給日本對蝦注射細菌后，其血淋巴凝集活力發生明顯變化[12]。用弧菌誘導過的中國對蝦，凝集素凝集活力明顯增強，而在己發病的病蝦體中的凝集素活力下降[14]。本試驗結果表明，以3種中草藥連續投喂克氏原螯蝦1個月后其凝集活性明顯提高，這說明中草藥能提高克氏原螯蝦非特異性免疫能力。無獨有偶，采用添加0．5%和1．0%的復方中草藥投喂河蟹(Eriocheirsinensis），其血清的凝集效價均得到了顯著的提高[15]。

凝集素存在的部位在不同的生物中存在差異。早在1982年，Vasta[16]曾在美洲巨蠣(Crassostrea virginica）的血清中發現有2種血細胞凝集素：一種游離存在于牡蠣的血清中，另一種可以牢固地吸附在牡蠣血細胞的細胞膜上，這種細胞膜結合型的血細胞凝集素能夠凝集馬、貓、小鼠等多種動物的血細胞，推斷這種細胞膜結合型的凝集素可能會在異物識別中提供受體位點，以促進牡蠣血細胞同外源異物間的結合，從而有利于異物的排除，增強了免疫功能。但在中國對蝦血細胞的細胞膜上沒有發現凝集因子的存在，說明中國對蝦的血細胞凝集素可能僅僅游離并存在于血淋巴液中，而未與血細胞發生吸附[17]。

凝集素活性的測定方法常見的有2種，一種是通過凝集素與新鮮的或經甲醛、戊二醛固定的動物紅細胞凝集反應的效價來測定，另一種是用分光光度法測定[12]。第一種方法是利用 “雙倍系列稀釋法”通過肉眼觀察試驗結果，因而測量誤差較大。而且有時會導致試驗失敗，例如牟海津等[17]采用 “雙倍系列稀釋法”研究中國對蝦血細胞膜制品對雞、小鼠、兔等動物的血紅細胞進行凝集試驗時，均未發現有凝集現象的發生。而分光光度法是利用凝集素與紅細胞相互作用后，凝集的紅細胞下降快的原理，測定上清的光密度值[9]。本試驗也據此原理測定克氏原螯蝦血清凝集紅細胞活性，得到了較好的結果，也證明分光光度法效果相對較好。

陳皮、甘草、淫羊藿3種中草藥能夠誘導克氏原螯蝦溶血素和凝集素的產生，提高溶血素和凝集素在血淋巴液中的濃度，從而增強克氏原螯蝦的免疫功能。因此，在克氏原螯蝦養殖中，使用陳皮、甘草、淫羊藿等免疫增強藥物，有望對增強克氏原螯蝦的體質、減少病害的發生起到一定的作用。

[1]Wang W，Gu W，Ding Z F．A novel Spiroplasma pathogen causing systemic infection in the crayfishProcambarusclarkii(Crustacea：Decapod）in China [J]．FEMS Microbiology Letters，2005，249：131-137．

[2]陳昌福，賀中華，孟小亮 ．湖北省克氏原螯蝦養殖現狀與產業發展中的技術問題 [J]．養殖與飼料，2008，3（11）：14-19．

[3]陳昌福，劉遠高，何廣文，等 ．克氏原螯蝦暴發病細菌性病原的研究 [J]．華中農業大學學報，2009，28（2）：193-197．

[4]曹劍香，簡紀常，吳灶和，等 ．凡納濱對蝦血清凝集素、溶血素的特性研究 [J]．海洋科學，2006，30（6）：1-5．

[5]戴聰杰，陳寅山 ．南美白對蝦血清凝集素的凝集活性及部分性質研究 [J]．水產科學，2005，24（1）：13-16．

[6]徐海圣 ．中華絨螯蟹常見病原的分離鑒定、致病及免疫機制研究 [D]．杭州：浙江大學，2004．

[7]錢 昆，周 濤 ．植物香辛料復配抑菌效果的研究 [J]．食品與機械，2007，23（2）：93-95．

[8]張國斌 ．胭脂魚幼魚適宜蛋白能量水平及中草藥對其非特異性免疫機能的影響 [D]．武漢：華中農業大學，2009．

[9]王者鵬，荊云鵬，金 瑾 ．分光光度計法測定凝集素對紅細胞的凝集活性 [J]．濱州醫學院學報，1990，13（1）：14-16．

[10]朱俊興，王 雷 ．中國對蝦(Fenneropenaeuschinesis）溶血素對人血紅細胞膜損傷的電鏡觀察及幾種糖類對其活性的影響 [J]．海洋與湖沼，2003，34（Special issue）：43-48．

[11]牟海津，江曉路，劉樹青 ．日本對蝦溶血素的活性測定及性能研究 [J]．海洋與湖沼，1999，30（4）：362-367．

[12]王長法，張士璀，王昌留 ．水生無脊椎動物凝集素研究概述 [J]．海洋科學，2005，29（4）：63-67．

[13]梁青龍，戴聰杰，陳寅山 ．南美白對蝦血清凝集素的凝集活性及部分性質研究 [J]．水產科學，2005，24（1）：13-16．

[14]王克夷，許 強 ．凝集素和毒素 [J]．生物化學與生物物理學報，2000，32（3）：201-205．

[15]崔青曼，張耀紅 ．復方添加劑對河蟹成活率及抗感染能力的影響 [J]．水利漁業，2001，21（4）：40-41．

[16]Vasta G R．A cell membrane-associated lectin of the oyster hemocyte [J]．J Inver pathol，1982，40：367-377．

[17]牟海津，江曉路，劉樹青 ．中國對蝦血細胞凝集素的性能研究 [J]．中國水產科學，1999，6（3）：32-35．