硫酸鹽還原菌WH16-1 對煙草吸收鎘的影響

周高婷，杜劍波

1.上海紀凱科技服務有限公司，上海 212000；2.上海完形健康管理咨詢有限公司，上海 212000

目前，土壤重金屬污染廣泛存在。我國土壤的重金屬總超標率為16.1%，其中土壤鎘超標率達7%[1]。土壤中鎘存在形式的不同會影響其植物有效性，植物有效性從大到小的順序依次為交換態、碳酸鹽結合態、鐵錳氧化物結合態、有機結合態和殘渣態。施用無機礦物蒙脫石可以降低土壤中鎘的生物有效性，促進水稻生長[1]。施用硫酸鹽還原菌WH16-1 也可以降低土壤中鎘的生物有效性，從而增加水稻產量、減少水稻中鎘的含量[2]。

煙草是一種重要的經濟作物，煙葉中鎘的含量嚴重影響著煙草的品質。煙葉中鎘的含量與土壤中鎘的含量密切相關，我國煙葉主產區中煙葉的鎘含量遠超過食品中的允許值——0.2 mg/kg[3]。本文利用土壤盆栽和大田實驗探究了細菌WH16-1 對煙草產量、葉綠素和酶活的變化及煙草根莖葉中鎘含量的影響，驗證了其對鎘污染土壤的修復效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用菌株為WH16-1。細菌培養參照文獻[2]在LB 培養基中進行。煙草品種為云煙-87，由湖北省煙草公司恩施州公司提供。煙草幼苗于實驗開始前30 d 左右播種培育，待幼苗長到15 cm 左右，選擇健康、長勢均一的煙苗進行實驗。

1.2 煙草盆栽實驗

采用恩施市望城坡農田土，土壤自然風干，去除大塊石頭及雜草。在每個盆中裝入15 kg 風干土壤，在盆底部墊上盆墊。按15 %含水率加水，并在每個盆中裝入數量相同、大小均一的小石頭，以便透氣。實驗設6 個處理，分別是：對照S（不加鎘和菌）、對照S+2Cd（加2 mg/kg Cd2+不加菌）、對照S+6Cd（加6 mg/kg Cd2+不加菌）、實驗組S+WH16-1（不加Cd2+加菌）、實驗組S+2Cd+WH16-1（加2 mg/kg Cd2+加菌）、實驗組S+6Cd+WH16-1（加6 mg/kg Cd2+加菌）。每種處理選取6 盆，共計36 盆。按照煙草盆栽實驗設計，分別加入硝酸鎘溶液或等量的去離子水對土壤進行處理，邊拌入鎘溶液邊攪拌土壤，使其混合均勻。采用深施覆土的方式按40 g/盆添加復合肥（復合肥N2O∶P2O5∶K2O =10∶10∶20）并拌勻。1 d后，加菌處理組加入500 mL/盆菌液，不加菌液的處理組加入等量0.9%氯化鈉溶液；3 d 后，在每盆土壤的相同深度處種植一株健康狀況、大小、葉片個數基本相同的云煙-87 煙苗。在盆栽過程中要保證土壤具有一定的濕度，定期補充水分并松土。按照煙草的正常生長條件進行管理。在煙草成熟期（120 d）取煙草樣品，同時取盆中距離地表15 cm 左右的煙草根際附近的土樣，土樣經風干研磨后過孔徑為0.25 mm 篩，植物樣品按照煙草常用的工藝進行殺青、烘干，及至含水率低于5 %。

1.3 煙草大田實驗

煙草大田實驗設計三個處理：不加鎘加菌的處理S、S+2Cd（加2 mg/kg Cd2+不加菌）及S+2Cd+WH16-1（加2 mg/kg Cd2+不加菌）。實驗田選在恩施望城坡，采用“X”法采集5 個地點的土樣，以井窯式種植煙草。田地起隴覆膜平衡好后，使用打孔機在隴上均勻打孔，按實驗設計將硝酸鎘溶液和菌劑WH16-1 分別施入孔內并與周圍土壤拌勻，不加硝酸鎘和菌液的處理中加入等量的去離子水，每個孔加入500 mL 水，按40 g/株添加復合肥（復合肥N2O∶P2O5∶K2O =10∶10∶20），拌勻后覆蓋土壤，防止曬干，并做好標記。每個處理選取34 株煙苗，不同處理之間隔兩株作為保護，每兩株間的行間距為80 cm，株間距為30 cm。按田間煙草正常生長管理模式進行管理，在煙草成熟期（90 d）取煙樣及土樣。

1.4 分析方法與實驗數據處理

在煙草成熟期（盆栽120 d，大田90 d）測量株高、株莖、葉片數并記錄。煙草取樣后，將其分成根、莖、葉并清洗晾干，在110 ℃殺青30 min 后以70 ℃烘干至恒重，測量煙草的干重并進行比較。

盆栽土壤中鎘、速效磷、堿解氮、有機質含量及土壤pH 分別為：2±0.57 mg/kg、3.65±0.24 mg/kg、310.99±10.48 mg/kg、20.66±2.57 g/kg 和7.88±0.13。大田土壤中的上述物質分別為：3±0.18 mg/kg、2.43±0.14 mg/kg、47.80 ±8.08mg/kg、20.86 ±0.71g/kg 和8.02±0.13。

實驗數據采用spss17.0 進行顯著性分析，其中方差分析采用One-Way、ANOVA、Duncan 檢測法對各處理間數據進行比較分析，顯著性水平為P＜0.05，顯著性差異用不同的小寫英文字母進行標示。圖表用Origin 8.0 繪制。

2 結果與討論

2.1 施加微生物菌劑對土壤中各形態鎘含量分布的影響

在盆栽煙草種植后120 d，土壤中各形態鎘含量的分布如圖1（A）所示。處理組S+WH16-1 與S相比，可交換態鎘及碳酸鹽結合態鎘的含量分別顯著降低了20.42 %、12.73 %（P＜0.05），鐵錳氧化物結合態鎘的含量基本無變化，有機結合態鎘及殘渣態鎘分別顯著增加了38.88 %和32.34 %（P＜0.05）。處理組S+2Cd+WH16-1 與S+2Cd 相比，土壤中可交換態鎘顯著降低10.40%（P＜0.05），碳酸鹽結合態鎘降低7.81 %，鐵錳氧化物結合態鎘、有機結合態鎘、殘渣態鎘分別增加19.60 %、22.76 %、27.20 %。其中，鐵錳氧化物結合態鎘、殘渣態鎘含量的降低達到顯著水平（P＜0.05），這種修復效果與許多研究報道的結果相一致，證明通過添加修復劑改變土壤中重金屬的化學形態，可以改善土壤的理化性質，減少對植物的毒害。

圖1 細菌對盆栽（A）及大田（B）土壤中Cd 的形態的分布影響

處理組S+6Cd+WH16-1 與S+6Cd 相比，施加菌劑WH16-1 使土壤中可交換態鎘降低1.14 %，碳酸鹽結合態鎘顯著降低7.55 %（P＜0.05），鐵錳氧化物結合態鎘、有機結合態鎘、殘渣態鎘分別增加3.02%、28.20 %、19.20 %。結果表明，菌劑WH16-1 對高濃度鎘污染土壤的修復效果不如對低濃度鎘污染土壤的。細菌WH16-1 對Cd 的最大抗性為9 mg/L，高濃度鎘抑制了其生長。因此，該細菌產生的H2S 少，不利于CdS 的生成。而該細菌及其分泌物的表面官能團少，也不利于其與Cd 發生絡合固定。

2.2 施加微生物菌劑對植物農藝性狀的影響

盆栽煙草和大田煙草的株高及生物量結果如圖2 所示。對比圖2（A）和圖2（C）中對照組S 與加菌組S+WH16-1 發現，加菌后株高顯著增加14.77 %（P＜0.05），生物量增加11.99 %；處理組S+2Cd+WH16-1 與S+2Cd 相比，加菌組的株高及生物量分別顯著增加12.13 %、14.77 %（P＜0.05）；處理組S+6Cd+WH16-1 與S+6Cd 相比，加菌組株高及生物量分別增加10.83 %、4.44 %。

圖2 菌劑WH16-1 對煙草成熟期株高及生物量的影響

從圖2（B）和圖2（D）中可以看出，不加菌不加鎘處理的對照組（S）的生物量及株高均不如實驗組。處理組S+2Cd 與加菌處理組S+2Cd+WH16-1 相比，加菌后煙草株高增加3.92 %，生物量顯著增加9.23%（P＜0.05）。

2.3 施加微生物菌劑對植物體內鎘含量的影響

在盆栽和大田煙草成熟期（90 d 和120 d）分別取煙草樣品，其不同部位的鎘含量如圖3，只加鎘處理組中煙草根、莖、葉及總鎘的含量相對于不加鎘的空白對照組均有所增加。

圖3 菌劑WH16-1 對煙草各部位鎘含量的影響

從圖3（A）中可以，看出120 d 時，不加鎘的對照組S 中煙草根、莖、葉中的鎘含量分別為114 μg/kg、81 μg/kg、75 μg/kg，處理組S+WH16-1 中各部位的鎘含量分別為100 μg/kg、76 μg/kg、48 μg/kg，相對于不加菌的對照組分別降低12.28 %、6.17 %、18.52 %；處理組S+2Cd 中各部位的鎘含量分別為331 μg/kg、118 μg/kg、102 μg/kg，處理組S+2Cd+WH16-1 中各部位的鎘含量分別為167 μg/kg、86 μg/kg、48 μg/kg，相對于只加鎘的對照組分別顯著減少49.54 %、27.12 %、52.94 %；處理組S+6Cd 中各部位的鎘含量分別為710 μg/kg、202 μg/kg、150 μg/kg，處理組S+6Cd+WH16-1 中各部位的鎘含量分別為603 μg/kg、185 μg/kg、85 μg/kg，相對于只加鎘的對照組依次減少16.07 %、8.42 %、43.33 %。加菌處理后葉片中的鎘含量均降到煙葉中鎘含量的允許標準（0.2 mg/kg）以下，且均達到顯著水平（P＜0.05）。

據3（B）可知，土壤中外源添加鎘后，植株各部位對鎘的吸收均有所增加。

上述結果表明，土壤中的鎘污染越嚴重，煙草對鎘的吸收越多；煙草中的鎘含量為根＞莖＞葉；添加菌劑WH16-1 可以減少煙草對鎘的吸收。

2.4 施加微生物菌劑對煙草植物體內酶活的影響

盆栽煙草120 d 葉片酶活測定結果如圖4（A）所示。對照組S 與加菌組S+WH16-1 相比，添加菌劑WH16-1 葉片中的葉綠素（Chl）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）分別增加6.94 %、25 %、23.96 %，戊二醛（MDA）含量顯著降低44.52%（P＜0.05）。處理組S+2Cd+WH16-1 與S+2Cd 相比，添加菌劑WH16-1 后過氧化氫酶顯著增加42.86 %（P＜0.05），葉綠素和超氧化物歧化酶略增加6.45 %和8.75 %，戊二醛僅降低2.35 %。處理組S+6Cd+WH16-1 與S+6Cd 相比，超氧化物歧化酶顯著增加78.98 %（P＜0.05），葉綠素和過氧化氫酶略增加19.61 %和4.55 %，丙二醛降低4.65 %（P＜0.05）。

圖4 煙草成熟期植物葉部酶活的比較（A，盆栽；B，大田）

對比圖4（B）中處理組S+2Cd+WH16-1 與S+2Cd 發現，施加菌劑WH16-1 后，葉片中葉綠素含量顯著增加32 %（P＜0.05），過氧化氫酶活性增加1.86%，丙二醛含量降低19.46 %。

相比于對照組，加入菌劑WH16-1 后，煙草中丙二醛含量降低，說明煙草細胞膜受到傷害少。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶都是幫助植物抵抗膜脂過氧化的重要保護酶，它們組成了一個有效的活性氧自由基清除系統，能夠快速清除活性氧，降低植物在逆境條件下的受損程度。菌劑WH16-1 的加入改變了土壤中鎘的化學形態，減少了能夠被植物直接利用的鎘的濃度，煙草受低有效態鎘的影響，清除活性氧的酶系統活性增強，有關酶濃度變大，用以清除鎘脅迫下煙草植株內產生的過多的活性氧，減少細胞膜的脂質過氧化使MAD 濃度降低，緩解了Cd 脅迫對煙草的毒害作用。此外，菌劑WH16-1 的加入使煙草中的葉綠素含量升高，不僅有利于煙草的光合作用，也提升了其生物量。

3 結論

在鎘污染土壤中施加硫酸鹽還原菌WH16-1不僅降低了土壤中交換態鎘和碳酸鹽結合態鎘的含量，增加了鐵錳氧化物結合態鎘、有機結合態鎘和殘渣態鎘的含量，還有效固定了土壤中的鎘，降低土壤中鎘的生物有效性；同時，增加了煙草的生物量，減少了其根莖葉對鎘的吸收，降低了煙葉中的鎘含量。