100株肺炎鏈球菌耐藥性分析

鄧林強，陳 會，郭建軍，孫 敬，余理智，熊章華

(1.江西省人民醫院檢驗科，江西 南昌 330006；2、浙江臺州骨傷醫院檢驗科，浙江 臺州 317500)

100株肺炎鏈球菌耐藥性分析

鄧林強1，陳 會1，郭建軍2，孫 敬1，余理智1，熊章華1

(1.江西省人民醫院檢驗科，江西 南昌 330006；2、浙江臺州骨傷醫院檢驗科，浙江 臺州 317500)

目的了解肺炎鏈球菌耐藥情況和β-內酰胺類抗生素MIC濃度檢測的意義。方法對我院收治的社區獲得性肺炎患者中呼吸道標本分離出的100株肺炎鏈球菌進行7種抗菌藥物MIC濃度檢測和苯唑西林 (OX)的K-B法檢測。結果①100株肺炎鏈球菌中，耐青霉素肺炎鏈球菌占13%；頭孢噻肟和左旋氧氟沙星的耐藥率都為6%；對紅霉素、克林霉素和四環素耐藥率分別為84%、80%和88%；對萬古霉素則全敏感。②K-B法檢測出苯唑西林敏感59株(占59%)。 結論 本院收治的社區獲得性肺炎患者中的肺炎鏈球菌對部分抗生素耐藥性比較嚴重，但青霉素仍具有較好的體外抗菌活性。且β-內酰胺類抗生素進行MIC濃度測定是有必要的。

肺炎鏈球菌；耐藥率；苯唑西林；MIC

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是社區獲得性肺炎的主要病原體，具有很高的發病率和病死率(尤其是老人和兒童)。在發展中國家，每年有500萬5歲以下的兒童死于肺炎鏈球菌引起的肺炎，10～50萬兒童死于肺炎鏈球菌引起的腦膜炎[1]。近年來肺炎鏈球菌引起的呼吸道感染已被列為研究重點之一[2]，耐藥率也逐年上升。為了解肺炎鏈球菌耐藥情況,現將我院2009年1月至2010年12月期間收治的社區獲得性肺炎患者呼吸道標本中分離出的100株肺炎鏈球菌的耐藥性進行分析,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 100株肺炎鏈球菌為我院2009年1月至2010年12月收治的社區獲得性肺炎患者標本中分離菌株。

1.1.2 培養基、藥敏紙片和試劑 MH瓊脂粉、苯唑西林(OX)紙片和 Optochin紙片(5μg/片)購自 OXOID公司(英國)。5%羊血瓊脂平板為本實驗室自制。肺炎鏈球菌鑒定及藥敏鑒定卡購自BD公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與鑒定

1.2.1.1 標本接種按操作規程[3]進行，標本直接涂片：①WBC大于25個/LP，EPC小于10個/LP；②見G+雙球菌，呈“矛頭狀”或“瓜子仁”狀排列；③WBC吞噬或伴行G+雙球菌。將接種了標本的平皿置6%CO2孵箱過夜培養。分離菌株經革蘭染色后，用BD公司的鏈球菌鑒定與藥敏卡進行鑒定和MIC濃度測定。

1.2.1.2 Optochin敏感性試驗 配制0.5麥氏單位菌液,用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂抹于含5%羊血MH瓊脂平板，10min后貼Optochin紙片一片,將平皿置35℃、6%CO2孵箱過夜培養。抑菌環直徑≥14mm為敏感。

1.2.1.3 膽汁溶解試驗(試管法)分別取1ml 6麥氏單位菌液于2只試管中，于一管菌液中加0.1ml 10%去氧膽酸鈉溶液,另一管中加0.1ml無菌生理鹽水，混勻后，置35℃孵箱15min取出，搖勻后觀察結果。加鹽水管菌液濁度不變，加去氧膽酸鈉溶液管菌液變澄清，判為膽汁溶解試驗陽性。

1.2.1.4 分子生物學鑒定 從待測菌中提取自溶素(lytA)基因并進行PCR擴增，并對擴增后的產物進行BsaAI酶切。1.5%瓊脂糖凝膠電泳(75V，60min)，溴化乙錠(EB)染色，紫外燈下觀察，結合DNA Marker判斷若出現761bp、452bp兩條帶即為典型的肺炎鏈球菌lytA基因。

1.2.2 藥敏試驗方法 OX藥物敏感試驗和Optochin敏感性試驗采用CLSI2010版推薦的紙片擴散法(KB法)進行；其他藥物的MIC濃度由BD Phoenix 100檢測；并根據CLSI 2010年版判斷標準進行藥敏結果判斷。

1.3 質控菌株 以上材料與方法所需用的質控菌株分別為金黃色葡萄球菌ATCC 25923和肺炎鏈球菌ATCC 49619。

2 結果

2.1 我院2009年1月至2010年12月收治的社區獲得性肺炎患者標本中分離出的100株肺炎鏈球菌，耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP，MIC≥8μg/ml)13株(占 13%)，中介(PISP)8 株(占 8%)，敏感(PSSP)79 株(占79%)；頭孢噻肟和左旋氧氟沙星的耐藥株都為6株(占6%)；對頭孢噻肟中介的肺炎鏈球菌有4株(占4%)，而對左旋氧氟沙星中介株為1株(占1%)；對紅霉素、克林霉素和四環素耐藥率比較高，分別為84%、80%和88%；對萬古霉素則全敏感。

2.2 100株肺炎鏈球菌經紙片擴散法(K-B法)測定，OX敏感(抑菌圈≥20mm)59株(占59%)。OX抑菌圈直徑≤19mm的41株肺炎鏈球菌(經MIC測定)對青霉素耐藥 13株(占 31.71%)、中介 8株(占 19.51%)、敏感20株 (占48.78%)；對頭孢噻肟耐藥6株 (占14.63)、 中介4株 (占9.76%)和敏感31株 (占75.61%)。

2.3 100株肺炎鏈球菌如以CLSI 2008版以前的判斷標準進行藥敏結果判斷，青霉素和頭孢噻肟的耐藥率將大大增加。其中青霉素的耐藥率為33%，而頭孢噻肟的耐藥率為13%。

3 討論

肺炎鏈球菌是社區獲得性感染的重要病原菌，自1967年澳大利亞Hansman等[4]首次分離出青霉素不敏感肺炎鏈球菌(PNSSP)以來，PNSSP在世界范圍內迅速傳播，近年來耐藥率迅速升高。實驗室在檢測青霉素及其它β內酰胺類抗生素藥敏時，由于還沒有可靠的紙片擴散法藥敏試驗，因此，用OX代替青霉素及其它β-內酰胺類抗生素。即當OX抑菌圈≥20mm的肺炎鏈球菌分離株對青霉素敏感。當OX抑菌圈直徑≤19mm時，就應檢測青霉素和頭孢噻肟的MIC值[5，6]。而本試驗數據顯示OX敏感59株。41株OX抑菌圈直徑≤19mm的肺炎鏈球菌經MIC測定，對青霉素和頭孢噻肟耐藥僅分別為13株(占 31.71%)和 6 株(占 14.63)。

2008 年以前美國臨床實驗室標準化協會公布的 《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》(即CLSI 2008及以前版本)判定肺炎鏈球菌對青霉素最低抑菌濃度(MIC)的標準為：≤0.06μg/ml為敏感[5]。CLSI 2009及以后版本對此進行了修改，標準改為：非腦膜炎時≤2μg/ml為敏感，4μg/ml為中介，≥8μg/ml為耐藥；腦膜炎時≤0.06μg/ml為敏感，≥0.12μg/ml為耐藥(沒有中介)[6]。判斷標準的改變就使得社區獲得性肺炎中分離出的肺炎鏈球菌對青霉素的敏感率大幅升高。這也就是本文中青霉素的耐藥率由33%降低到的13%，并出現8%中介的原因之一。頭孢噻肟的耐藥率降低也可能是出于此。

試驗中所分離出的100株肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素和四環素呈高水平耐藥，其中對紅霉素的耐藥率為84%(84株)，對克林霉素的耐藥率為80%(80株)，對四環素的耐藥率為88%(88株)，這與國內的報道相近[7-10]。其耐藥機制可能與erm基因介導核糖體靶位修飾、mef基因介導的主動外排機制和50S核糖體突變有關。肺炎鏈球菌對左旋氧氟沙星和萬古霉素都很敏感，萬古霉素的敏感率達到100%。

綜上所述，本院收治的社區獲得性肺炎患者中的肺炎鏈球菌對部分抗生素耐藥性比較嚴重，但青霉素仍具有較好的體外抗菌活性。

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[6]Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;20th informational supplement[S].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2010:M100-S20.

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R378.1+4,R446.5,Q939.92

B

1674-1129(2011)06-0633-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.06.021

江西省衛生廳課題，編號：20070324