內皮細胞缺氧后miR-210、miR-92a、miR-126表達及意義

劉 芬，婁遠蕾，阮瓊芳，謝 安，李 勇，崔蘇萍，汪 泱

(南昌大學第一附屬醫院，南昌330006)

研究證實，臟器缺血缺氧后可出現代償性的血管新生;microRNA與血管新生密切相關。在生物體的生長、發育及疾病發生中起重要作用［1］。前期我們研究發現，小鼠腎缺血后可出現血管新生，且microRNA(如 miR-210、miR-92a、miR-126)出現明顯改變［2］，但microRNA調控腎血管生成的機制尚不明確。2010年2～6月，我們觀察了人微血管內皮細胞缺氧后血管新生相關microRNA的表達變化，旨在為microRNA調控缺血缺氧后血管生成機制的研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗細胞:人微血管內皮HMEC細胞:購自長沙贏潤生物技術有限公司。主要試劑及儀器:Trizol Reagent(美國Invitrogen公司);逆轉錄試劑盒(美國Promega公司);核酸和蛋白分析儀(美國Bekman公司)，ABI 7500實時定量 PCR系統(ABI，美國)，CO2孵箱(美國熱電公司)，低氧培養箱(日本三洋公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞缺氧模型制作 將1×106個/ml的HMEC細胞接種于含20%FBS和EGF(10 ng/ml)M199培養液的培養瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，隔天換液。待細胞貼壁生長、增殖至約80%融合時，0.25%EDTA胰蛋白酶消化傳代。更換不含血清及EGF的M199培養液后分為兩組。缺氧組置于37℃低氧培養箱，通入5%CO2、94%N、1%O2混合氣體，低氧培養6 h;對照組置于5%CO2孵箱中培養。

1.2.2 觀察項目 ①細胞形態:于光學倒置顯微鏡下觀察兩組細胞形態學變化并照相。②細胞miR-210、miR-92a、miR-126表達:采用實時定量PCR法。收集細胞，采用Trizol法抽提總RNA，核酸測定儀測A260/A280(要求為 1.8 ～2.0)，1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量。采用stem-loop引物行miR-210、miR-92a、miR-126 逆轉錄［3］，反應條件:16 ℃、30min;30 ℃、30 s，42 ℃、30 s，50 ℃、1 s，共 60 個循環;70℃、15min。以U6為內參，采用SYBR GreenI qPCR方法進行擴增，檢測系統為ABI 7500 real time PCR system，反應條件:95 ℃、10min，95 ℃、15 s，60℃、30 s，40個循環。最后行融解曲線分析。每個樣本設3個重復管，同時設無模板陰性對照。基因表達的相對變化以2－△△Ct表示。實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.0軟件行統計學處理，計量數據資料用±s表示。組間差異比較采用小樣本t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態 與對照組比較，缺氧組細胞增殖變慢，細胞內顆粒增多，貼壁細胞減少，懸浮細胞增多。

2.2 miR-210、miR-92a、miR-126 表達 與對照組比較，觀察組 miR-210、miR-92a、miR-126分別上調了(5.19 ±0.99)、(3.02 ±0.88)、(3.87 ±0.83)倍，P 均 ＜0.05。

3 討論

microRNAs是一組21-25 nt長的非編碼蛋白質的短序列RNA，能通過堿基配對與mRNA分子的3'非翻譯區相結合，降解mRNA或抑制靶基因的翻譯，從而對基因進行轉錄后表達的調控。近年來研究發現，microRNA能夠通過調控與內皮細胞功能相關基因的表達參與內皮細胞和血管功能的調節;尤其是一些血管內皮細胞特異性和高表達的microRNA，在血管的病理生理過程中發揮著重要的調控功能。文獻報道，過表達miR-92a于正常臍靜脈內皮細胞上可阻斷血管出芽，抑制血管網形成及內皮細胞遷移［4，5］。Wang等［6］發現，抑制糖尿病大鼠來源的微血管內皮miRNA-320表達可促進血管內皮增殖和遷移。當大鼠miR-126缺失時，其血管完整性破壞和內皮細胞增殖、遷移及血管生成缺陷，將導致血管滲漏、出血及部分胚胎致死，而存活的miR-126缺失大鼠在心梗時也出現血管新生缺陷［7］。

血管內皮細胞是覆襯于全身血管和淋巴管內面的單層扁平細胞，在維持血管完整性、血管新生及創傷愈合中起重要作用，也是最先感受缺氧的細胞之一。研究證實，缺血臟器組織內皮特異性microRNA如 miR-210、miR-92a、miR-126 表達升高［7，8］。本研究證實HMEC細胞缺氧后內皮特異性 miR-210、miR-92a、miR-126均明顯上調;提示缺氧可促進內皮特異性microRNA表達改變，此可能為缺氧后血管新生的機制。

Fish等［9］研究證實，miR-126是通過負調控其靶基因Spred1和磷酸激酶-3調節亞基2(PIK3R2/p85-beta)從而促進血管新生的;而 Spred1和PIK3R2是VEGF信號通路的負調控因子。有報道，miR-210可通過促紅細胞生成產生肝細胞受體/ephrin配體，而Eph/ephrin信號通路介導血管內皮生長因子(VEGF)調控血管新生［10］。我們前期的體內實驗亦已證實，腎缺血性損傷后可出現代償性血管新生，缺氧可誘導miRNA-92a、miRNA-210表達上調，與血管新生相關的信號分子VEGF表達亦升高。結合生物學分析推測，miRNA-210、miRNA-92a均可直接或間接靶向VEGF，miRNA/VEGF-Notch1可能是腎缺血性損傷后血管新生的主要調控通路［11］。

綜上所述，缺氧可促使內皮細胞特異性microRNA表達改變;此可能為缺氧后血管新生的調控機制。關于缺氧后內皮特異性microRNA與血管新生相關信號分子表達的變化有待于進一步闡明。

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