微波制備IFN－γ處理的小鼠H22肝細胞疫苗免疫對小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響

楊曉峰，楊新宏，朱艷菊，丁曉旭，李曉明，孫立新

(承德醫學院附屬醫院，河北承德067000)

單核巨噬細胞系統是機體保持內環境穩定的一個最重要系統，廣泛參與免疫應答、免疫效應和免疫調節。巨噬細胞的功能是衡量機體免疫水平的一項重要標志，為機體免疫清除突變細胞的重要因素。2007年9月，我們根據IFN－γ可促進MHC－I類抗原表達，微波修復抗原可提高病理組織的抗原性原理，應用IFN－γ和微波制備全細胞瘤苗，觀察了此瘤苗對巨噬細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/C小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量14～16 g，8周齡，正常飼養。肝癌細胞H22瘤株:由白求恩醫科大學提供，液氮凍存。使用時復蘇細胞，接種于含10%胎牛血清(FBS)的1640培養基，培養至對數生長期 ，接種于BALB/C小鼠腹腔傳代。

1.2 H22肝癌細胞疫苗(MITTV－H22)及 H22細胞抗原的制備 ①MITTV－H22制備。收集 BALB/C小鼠腹水H22腫瘤細胞，1640培養液洗2遍，常規培養，并加入 IFN－γ(200 U/ml)，培養 48 h［1］。收集H22細胞，生理鹽水洗2遍，制成2.5×106/ml的細胞懸液，微波照射20 s(750 W、2450兆赫)，制成MITTV－H22，4℃儲存備用。經臺盼藍染色鏡下觀察證實腫瘤細胞已全部滅活。②H22細胞抗原制備。收集H22細胞，生理鹽水洗2遍，調至1×107/ml，將細胞懸液置－80℃冷凍，37℃水浴溶解，反復凍融4次。13 000 r/min、離心60min，吸取上清，過濾除菌，分裝，－80℃保存備用。

1.3 實驗分組與動物模型制備 小鼠檢疫10 d后隨機分組。實驗組右后肢外側皮下接種MITTVH22懸液0.2 ml，每周免疫1次，共3次;對照組用生理鹽水代替MITTV－H22。末次免疫后第7天處死小鼠，腹腔內注入預冷的Hank's液5 ml/只，輕輕按揉腹部，以充分洗出腹腔巨噬細胞;將腹壁剪開一個小口，吸取腹腔灌洗液收集腹腔巨噬細胞，進行后續實驗。各組在同等條件下飼養，均自由飲食。

1.4 巨噬細胞表面分子MHC－Ⅱ表達水平測定［2］腹腔巨噬細胞與H22抗原(1∶10)37℃、5%CO2共培養18 h。收集巨噬細胞PBS洗3次后棄上清，加入MHC－Ⅱ熒光抗體，4℃暗室孵育30min，加入PBS 500 μl，流式細胞儀檢測熒光強度。

1.5 吞噬率計算 吸取0.5 ml含0.5%雞紅細胞的巨噬細胞懸液，加入玻片上，37℃孵育15～20min。迅速用生理鹽水沖掉未貼壁細胞，吉姆薩染色，鏡下計數吞噬率。吞噬率(%)=(吞噬紅細胞的巨噬細胞數/巨噬細胞總數)×100%。

1.6 細胞周期測定 將腹腔巨噬細胞與H22抗原(1∶10)37℃、5%CO2共培養18 h。同時常規制備MITTV－H22免疫小鼠脾淋巴細胞懸液，與巨噬細胞(經H22抗原處理18 h)共孵育(24孔板，脾淋巴細胞1×107/孔，巨噬細胞1×104/孔)24 h。收集懸浮的脾淋巴細胞，PBS洗3遍，棄上清，調為1×107/ml細胞懸液，取 100 μl加入 Hamster anti mouse CD69－PE抗體，室溫避光30min，加入500 μl PBS混勻，FACS檢測脾細胞表面抗原CD69分子。同時另取脾淋巴細胞懸液［3，4］，PBS 洗 3 遍，75%乙醇固定過夜。PBS洗 3次，棄上清，剩余 50 μl細胞懸液，加入RNase A(1 mg/ml)100 μl，37 ℃ 孵育 30min，加入PI(0.5 mg/ml)50 μl，PBS 800 μl，室溫避光 30min，流式細胞儀測定細胞周期。

1.7 統計學方法 應用SPSS15.0統計軟件，行兩獨立樣本t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腹腔巨噬細胞表面分子MHC－Ⅱ表達率 實驗組與對照組巨噬細胞表面分子MHC－Ⅱ的表達率分別為 85.95% ± 1.50%、62.71% ± 1.86%，P=0.000(t=30.808)。

2.2 巨噬細胞吞噬率 實驗組與對照組巨噬細胞吞噬率分別為 35.30% ±9.79%、15.00% ±6.63%，P=0.000(t=5.429)。

2.3 脾淋巴細胞表面CD69表達 實驗組與對照組脾淋巴細胞表面 CD69表達率分別為11.96% ±4.20%、5.94% ±1.41%，P=0.016(t=3.038)。

2.4 細胞周期 實驗組與對照組S+G2－M期脾淋巴細胞所占比例分別為51.17% ±3.11%、31.56%±2.59%，P=0.000(t=9.684)。

3 討論

MHC－Ⅰ類分子表達于所有有核細胞，而腫瘤往往表達明顯減少或丟失，不能引起有效的殺腫瘤效應［5］，從而逃避宿主的免疫攻擊。腫瘤細胞表面“抗原覆蓋”或“抗原遮蔽”是腫瘤細胞逃避免疫攻擊的另一因素。抗原覆蓋是指腫瘤細胞表面抗原可能被某些物質所覆蓋，如腫瘤細胞可表達高水平的唾液黏多糖或表達腫瘤激活的凝聚系統，均可覆蓋腫瘤抗原。腫瘤抗原可經糖基化等方式隱藏，這一過程稱為抗原遮蔽。可致腫瘤抗原不能被宿主的淋巴細胞所識別，不能有效地被殺傷。IFN是調節MHC－Ⅰ類抗原表達的一個重要生物因子［6］。IFN－1、IFN－2均可引起MHC－Ⅰ類抗原表達增高，但IFN－γ的作用更強。微波作為抗原修復的方法已廣泛用于免疫組織化學染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修復方法，其可使病理切片的抗原更充分暴露，提高免疫組化染色的敏感性。小鼠H22肝癌細胞株腫瘤抗原性弱，MHC－Ⅰ表達缺失。基于IFN－γ的上調MHC－Ⅰ和微波暴露抗原的原理，我們用IFN－γ和微波共同處理H22腫瘤細胞，制備MITTV－H22瘤苗，既消滅了其致瘤性又增加了其表面MHC－Ⅰ及抗原的表達，可提高其抗原呈遞能力和抗原性。

在機體的免疫系統中，巨噬細胞由于其活躍的生物學功能，尤其是在免疫應答和機體防御機制中的作用而一直受到重視，是腫瘤生物學療法中的重要應答和調動環節之一［7］，其擔負著吞噬細菌、提呈抗原、啟動特異性免疫應答、抗腫瘤并參與免疫調節等作用［8］。巨噬細胞直接吞噬腫瘤細胞，顯示出非特異性殺瘤作用，同時巨噬細胞作為抗原提呈細胞，將攝入的腫瘤細胞消化、加工，并將特異性抗原以MHC限制的形式遞呈給T淋巴細胞，從而參與特異性腫瘤免疫［9，10］。巨噬細胞的吞噬功能有利于其清除腫瘤，亦是其加工處理抗原的前提。本研究結果顯示，MITTV－H22瘤苗免疫小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能增強，有利于巨噬細胞功能的發揮。巨噬細胞表面MHC－Ⅱ類分子的表達是抗原提呈的分子基礎，本實驗MITTV－H22瘤苗免疫小鼠腹腔巨噬細胞MHC－Ⅱ類分子表達增強，有利于其抗原提呈功能的發揮。因巨噬細胞活化淋巴細胞的能力是其抗原提呈功能實現的具體表現，故淋巴細胞增殖表達的CD69等活化分子，可以作為淋巴細胞活化的標志。

T細胞活化后表達數個膜表面分子，包括CD69、IL－2受體CD25、轉鐵蛋白受體CD71，被稱為活化標志。CD69是其中表達最早的一個，刺激后1～2 h即可在T細胞表面發現并迅速達到高峰，表達可持續72 h［11］。靜止狀態的T細胞不表達CD69，但當T細胞受刺激活化后可誘導性表達CD69。T細胞表面CD69與其單克隆抗體結合可引發細胞外Ca2+的內流，細胞內 TNF、IFN－γ 等細胞因子分泌，IL－2 及其受體合成與表達，增強轉錄因子AP－1的活性，并通過細胞內信號傳導增強T細胞的增殖;因此其被認為是一個T細胞增殖的共刺激信號。本研究MITTV－H22瘤苗免疫后小鼠腹腔巨噬細胞誘導淋巴細胞表達CD69增多，表明活化淋巴細胞的能力增強。

細胞周期反映細胞增殖過程，按其染色體行為而人為分為 G1期(DNA合成前期 )、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有絲分裂期)，細胞經上述四期而完成其增殖，其中暫時脫離細胞周期不進行細胞增殖的細胞稱為G0細胞。通過流式細胞術檢測細胞DNA含量可將細胞分為G0/G1期(DNA為二倍體)、G2/M期(DNA為四倍體)和S期(DNA介于二者之間)。S期和G2/M期細胞均為增殖期細胞，其細胞比例可反映細胞的增殖活性。本實驗結果顯示，MITTV－H22瘤苗免疫小鼠其腹腔巨噬細胞可使淋巴細胞S期和G2/M期的細胞比例增加，顯示淋巴細胞增殖活性增強，表明巨噬細胞活化淋巴細胞能力增強。

總之，MITTV－H22免疫小鼠，可使其腹腔巨噬細胞表面MHC－Ⅱ類分子的表達升高，吞噬活性明顯增強，誘導脾淋巴細胞表面分子CD69表達增高并使脾淋巴細胞G2/M期和S期的比例升高。提示MITTV－H22瘤苗免疫接種可提高巨噬細胞的功能，使其更好地在抗腫瘤免疫中發揮作用。

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