破骨細胞分化刺激因子在佐劑性關節炎大鼠滑膜中的表達及意義

石國勛，鄭祥雄，任天麗

(1無錫市第二人民醫院，江蘇 無錫 214002;2福建醫科大學附屬協和醫院)

研究發現，類風濕關節炎(RA)滑膜中破骨細胞的大量形成是引起RA軟骨和骨破壞的關鍵因素。破骨細胞分化刺激因子(ODF)為NF-κB配基受體激活劑，與骨保護素(OPG)一起是調節破骨細胞形成和活化的重要因子［1］。2005年1月～2006年7月，本實驗用佐劑性關節炎(AA)模型模擬人RA的早期臨床表現，研究滑膜中ODF基因表達與破骨細胞形成和活化的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠20只，雌性，體質量為(200±10)g，由上海實驗動物中心提供。Trizol試劑為Gibco公司產品，RT-PCR試劑盒為Promega公司產品，完全弗氏佐劑、TRAP染色試劑盒為 Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 AA大鼠模型的制備 20只SD大鼠隨機分為兩組各10只，麻醉后一組于右足墊皮下注射完全弗氏佐劑0.1 ml(模型組)，另一組大鼠注射0.1 ml的生理鹽水(對照組)。

1.2.2 滑膜及其關節的組織病理學檢測 于模型制備后30 d斷頭處死大鼠，分離病變的膝關節，經脫鈣、脫水，常規石蠟包埋切片、HE染色。同樣方法處理對照組大鼠關節滑膜組織。

1.2.3 滑膜組織總RNA抽提 提取滑膜組織，Trizol試劑盒提取RNA，干燥后用DEPC處理的去離子水50 μl溶解RNA，用核酸紫外分析儀檢測RNA的含量。

1.2.4 RT-PCR 法檢測滑膜中 ODF、OPG、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)基因表達 按照逆轉錄試劑盒步驟逆轉錄合成cDNA，產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。凝膠電泳經Fuji Film圖像處理，輸入Image Master VDS凝膠成相系統做灰度掃描，進行基因表達強度分析。結果以目的條帶與內參照β-actin的灰度比值表示。

1.2.5 滑膜組織破骨細胞TRAP染色 用TRAP染色試劑盒進行組織化學染色，按說明書進行操作。常規脫水、封片，鏡下觀察結果。

1.3 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件;實驗數據用表示，組間比較采用成組t檢驗;各指標間的關系用Spearman相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病變膝關節HE染色 致炎30 d后，AA大鼠關節滑膜增生，滑膜襯里層增厚，滑膜細胞增生肥大，成絨毛狀排列紊亂，向關節腔內突出。在滑膜和軟骨交界處有新生血管翳形成，各種炎性細胞浸潤，軟骨和骨被破壞。

2.2 ODF、OPG、TRAP基因表達 AA大鼠滑膜組織中ODF mRNA和TRAP mRNA的相對表達水平分別為0.880 ±0.056 和0.681 ±0.050，而對照組分別為0.109 ±0.013 和0.093 ±0.014，兩組相比有統計學差異(P均＜0.01);OPG mRNA對照組和AA組分別為0.231 ±0.051、0.253 ±0.043，兩組相比無統計學差異(P＞0.05)。經相關性分析，TRAP的表達水平與 ODF/OPG呈正相關(r=0.932，P＜0.01)。

2.3 滑膜組織破骨細胞TRAP染色 TRAP染色顯示，在滑膜組織和滑膜—軟骨交界處及侵蝕軟骨表面增生的單個核和多個核且胞質內有深紅色顆粒沉淀，即為 TRAP陽性的破骨或破骨前提細胞。Spearman相關分析表明，AA大鼠病變膝關節石蠟切片中TRAP陽性細胞的數量與軟骨損傷的程度呈正相關(r=0.941，P ＜0.01)

3 討論

AA模型是一種免疫炎癥性模型，在臨床和病理上有著與人RA相似的特點，可以作為人類RA較為理想的疾病模型［2］。在病理切片上，AA組大鼠關節囊內滑膜增生，新生血管翳形成，并有大量炎癥細胞浸潤、軟組織水腫、關節間隙增寬，軟骨和骨破壞，與文獻［3］報道一致，說明AA模型成功，在一定程度上可以反映RA活動期的表現。

目前，對于破骨細胞的激活和增殖信號傳導有兩個途徑，主要途徑是ODF/RANK/NF-κB或蛋白激酶JAK通路［4］，次要通路是炎癥因子非 ODF/RANK依賴通路。如IL-1、TNF等炎癥因子可誘導單核巨噬細胞系分化為有功能的破骨細胞ODF及其轉換受體(RANK)，是腫瘤壞死因子受體超家族成員，具有刺激破骨細胞前提細胞分化為破骨細胞的功能，并可延長其生存時間［5］。OPG是一種分泌性蛋白，是ODF的誘騙受體，和RANK共同競爭與ODF結合，抑制ODF的生物學活性。本研究顯示，AA組大鼠滑膜中大量表達ODF，而在正常組則表達很少，OPG的表達兩組則無明顯差別。同時我們也檢測到破骨細胞的標志TRAP的表達與ODF表達一致，說明了ODF的表達與破骨細胞的形成和活化有關。

［1］Nakano K，Okada Y，Saito K，et al.Induction of RANKL expression and osteoclast maturation by the binding of fibroblast growth factor 2 to heparan sulfate proteoglycan on rheumatoid synovial fibroblasts［J］.Arthritis Rheum，2004，50(8):2450-2458.

［2］Akiyama T，Mori S，Mashiba T，et al.Incadronate disodium inhibits joint destruction and periarticular bone loss only in the early phase of rat adjuvant-induced arthritis［J］.J Bone Miner Metab，2005，23(4):295-301.

［3］Egan CG，Lockhart JC，Ferrell WR.Pathophysiology of vascular dysfunction in a rat model of chronic joint inflammation［J］.J Physiol，2004，557(Pt 2):635-643.

［4］Sabokbar A，Kudo O，Athansou NA.Two distinct cellular mechanisms of osteoclast formation and bone resorption in periprosthetic osteolysis［J］.J Orthop Res，2003，21(2):73-81.

［5］Bugress TL，Qian Y，Kaufman S，et al.The ligand for osteoprotegerin directly activates mature osteoclast［J］.J Cell Biol，1999，145(1):527-538.