不同采收期黃芩HPLC指紋圖譜比較研究

楊亞麗 吳 芳 楊瑞瑞 陜西省食品藥品檢驗所 (西安 710061)

黃芩為唇形科植物黃芩 Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根 ,性苦寒,歸肺、膽、脾、大腸、小腸經。有清熱燥濕,瀉火解毒,止血安胎之功效。用于濕溫、暑濕,胸悶嘔惡,濕熱痞滿,瀉痢,黃疸,肺熱咳嗽,高熱煩渴,癰腫瘡毒等癥,是我國中醫臨床常用大宗藥材品種之一。黃芩含有多種化學成分,目前從黃芩中提取并鑒定出結構的黃酮類成分已有十幾種,含量較高的成分有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素。黃芩主產區為我國的西北地區、華北地區、東北地區。就品質上而言,種源為山東和陜西的藥材綜合指標較高。 2010版《中國藥典》規定黃芩采收期為春秋二季,但不同采收期對黃芩藥材化學成分及其質量有無影響,目前尚無報道。我們對收集到陜西產的 20批樣品,以黃芩苷為指標,建立了陜西省不同采收期黃芩的標準指紋圖譜,為黃芩藥材全面質量控制提供可靠的科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters-Alliance2695-2487(G02SMT649M)高效液相色譜儀。

1.2 試藥 水為超純水,乙腈、甲醇為色譜純,其它試劑均為分析純。黃芩苷,批號 110736-200423)中國藥品生物制品檢定所提供。黃芩樣品采自陜西省不同地區,共 20批,其中 1～10批為春季采收,11～20批為秋季采收。經陜西中醫學院王繼濤教授鑒定為唇形科植物黃芩 Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 選用 SUPELCO DiscoveryC18柱(250mm×4.6mm,5 μ m);乙腈 (A)20.25% 磷酸(B)-四氫呋喃(C)為流動相進行梯度洗脫:0～14 m in(21%A-78%B-1%C),17 m in(28%A-71%B-1% C),25 m in(31% A-68% B-1% C),45～60 m in(39% A-60%B-1% C),65 m in(30% A-69%B-1%C),70 m in(21%A-78%B-1%C)。檢測波長 274 nm;體積流量 1.0 mL/m in;柱溫 30℃;進樣量 10 uL;理論板數按黃芩苷峰計算應約為 2×105,與其他峰的分離度均大于 1.0。所有組分均在 70 m in內被檢測完。

2.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解并稀釋制成 0.1m g/mL的溶液,作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取黃芩藥材粉末(過 5號篩)0.2 g,精密稱定,置 100 m L量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,稱定重量,超聲提取 45 m in,取出,放冷,用甲醇補足重量,搖勻,濾過,取續濾液 2 mL置5 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,微孔濾膜(0.45um)濾過,即得供試液。

測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 10 μL,注入液相色譜儀。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗:精密吸取同一份樣品溶液(No.10)10 μL,連續進樣 5次,計錄 HPLC色譜圖。測得供試品溶液各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于 3%,表明精密度良好。

2.4.2 重復性試驗:取同一批樣品(No.10)6份,按 2.3項方法制備供試品溶液,分別進樣 10 μL,計錄HPLC色譜圖。測得供試品溶液各共有峰相對峰面積和相對保留時間的 RSD均小于 3%,表明方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗:精密吸取同一份黃芩(No.10)供試品溶液,分別在 0,2,4,6,8,10,12,24h進樣10 μL,計錄 HPLC色譜圖。測得供試品溶液各共有峰相對峰面積和相對保留時間比值無明顯變化,RSD均小于 3%,表明供試品溶液在 24h內穩定。穩定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的制備:取春秋季采收的黃芩樣品各 10批,按 2.3項方法制備供試品溶液,分別進樣10 μL,計錄 HPLC色譜圖。將藥材指紋圖譜導入中藥色譜相似度評價系統軟件(2004 A版),設定匹配模板,進行譜峰自動匹配,并生成對照指紋圖譜,結果見圖 3～6。 20批樣品共有峰相對保留時間、相對峰面積范圍分別見表1、表2。

2.5.2 共有峰的確定:10批春季樣品生成的對照指紋圖譜,有 11個共有峰;10批秋季樣品生成的對照指紋圖譜,有 14個共有峰;通過與對照品對照,分別指認春季 8號峰,秋季 11號峰為黃芩主要指標成分黃芩苷。

2.5.3 指紋圖譜的相似度評價:分別采用 SPSS軟件的相關系數法、夾角余弦法以及國家藥典委員會中藥色譜相似度評價系統軟件(2004 A版),對不同采收期黃芩樣品進行相似度計算,計算所有樣品的相似度。結果不同方法所得相似度結果趨于一致,秋季采收的黃芩樣品相似度明顯高于春季采收的樣品,說明不同采收期的黃芩藥材所含化學成分有一定的差異。

3 討 論 3.1 在流動相系統的選擇中,分別以乙腈-水、乙腈-0.25% 磷酸、甲醇-水、乙腈-0.25%磷酸-四氫呋喃作為流動相,結果用乙腈-0.25% 磷酸-四氫呋喃梯度洗脫,分離效果最佳。用不同的檢測波長檢測分析,274nm處指紋峰較多,響應值均較大,且基線較平穩,有利于指紋圖譜的分析。故選擇 274nm作為檢測波長。

3.2 本實驗比較了不同提取溶劑如 70%乙醇、50%甲醇、甲醇的不同提取方法的提取效果,以甲醇提取的總體效果為佳。采用甲醇提取,可將其不同成分完全表述。70% 乙醇雖可將黃芩苷提取更完全,但指紋圖譜只傾向于某幾個峰,甲醇提取黃芩苷的峰相對低些,但就指紋圖譜的整體性而言更合適一些。同時還考察了以甲醇為提取溶劑,不同提取時間(30、45、60 m in)的提取效果。結果表明,以甲醇為提取溶劑,超聲提取 45 m in,提取較完全,且方法穩定、重現性好。

3.3 本實驗用不同的數據處理方法對數據進行分析,由得出的相似度結果可知,20個樣本間有較好的相關性,但又有區別。

3.4 秋季采收的黃芩樣品相似度明顯高于春季采收的樣品,說明不同采收期的黃芩藥材所含化學成分有一定的差異。通過指紋圖譜對不同采收期黃芩藥材進行綜合宏觀分析,有利于全面控制藥材質量,促進黃芩藥材及其制劑質量控制的全面提高。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一)部.[M].北京:化學工業出版社.2005,211.

[2]Technical Requirement ofthe Fing erprint in Injection of Chinese Materia Medica(Tentative Standard)[中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)][S].2001.

[3]Zhang K R,Bi K S1Study on fingerprint of Rad ix Paeoniae Rubra by HPLC[J]1 Chin Trad it Herb Drugs(中草藥),2003,34(11):1048-1051.