體外培養(yǎng)和誘導人臍帶源間充質干細胞定向分化為心肌細胞的實驗研究

阮中寶，楊向軍，陳各才，朱 莉，李 偉，楊 兵，歐陽溪，潘少輝

(1蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006;2泰州市人民醫(yī)院;3江蘇省北科生物科技有限公司)

間充質干細胞(MSC)具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點，在一定條件下能分化成為各種功能細胞，可被應用于多種疾病的治療［1～3］。5-氮胞苷(5-aza)是胞嘧啶核苷的類似物，可引起DNA中某些胞嘧啶的低甲基化，從而參與激活表型特異性基因。2011年6～12月，本研究通過對人臍帶源間充質干細胞(hUC MSCs)體外分離、培養(yǎng)，并采用5-aza誘導，旨在研究其在體外誘導分化為心肌細胞的可行性。

1 材料與方法

1．1 材料 5份臍帶標本來源于泰州市人民醫(yī)院2010年9月份產科足月順產或剖宮產胎兒。主要試劑和儀器:DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO，NVF0274);通用型SP Kit廣譜免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒、Anti-cTnI抗體(北京博奧森生物技術有限公司);倒置顯微鏡(日本Olympus)。SP-9000:生物素標記山羊抗兔、大鼠和豚鼠IgG;SP-9001:生物素標記山羊抗兔IgG;SP-9002:生物素標記山羊抗小鼠IgG。

1．2 實驗方法

1．2．1 hUC MSCs的分離和培養(yǎng) 取采集24 h內的新鮮臍帶至培養(yǎng)平皿中，將臍帶沿結扎內側剪斷，取中間部分。加入適量的生理鹽水，洗滌臍帶至表面干凈無血，將臍帶移至另一培養(yǎng)平皿中;將臍帶剪成2～3 cm的小段，沿靜脈血管剪開，將靜脈血管壁和動脈血管剝離;將華通膠剝離，用組織剪剪碎至1 mm3大小，接種于T75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為10 ml含10%FBS的DMEM/F12，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。待細胞60%融合后，1∶3傳代。傳至3代后，部分細胞冷凍保存，部分細胞用于實驗。整個過程在無菌條件下進行。

1．2．2 hUC MSCs的誘導 P3代細胞常規(guī)消化收集，用PBS清洗2次，調整細胞密度為2×104/ml，重新接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁(約10%融合)，培養(yǎng)液中加入終濃度為10 μmol/L的5-aza培養(yǎng)24 h，吸去含5-aza的培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，改用完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，設對照組5-aza的濃度為0 μmol/L，其他操作相同。持續(xù)培養(yǎng)4周，每3 d換液1次。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長和形態(tài)學的變化，分別于誘導前和誘導后1、2、3、4周進行拍照。

1．2．3 hUC MSCs免疫組化鑒定 將載有誘導分化4周后的MSC和對照組MSC的蓋玻片用PBS液輕輕洗滌浸泡5 min，按試劑盒說明書操作;顯微鏡下拍照，細胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞。

2 結果

2．1 誘導前后hUC MSCs形態(tài)變化 誘導前為典型的梭形，核/質比例高，胞質量少而均勻，無顆粒、細絲樣結構，核內可見明顯核仁，細胞呈同心圓或漩渦樣生長;處理24 h后，僅有少量細胞死亡;誘導后1～2周，細胞形態(tài)出現(xiàn)變化。細胞多緊密平行排列生長，細胞體積變大，紡錘形細胞比例下降，多數(shù)細胞呈桿狀，少部分細胞呈不規(guī)則外形、長梭形或橢圓形;3～4周，細胞增殖減慢，部分細胞脫壁死亡，細胞數(shù)量較同期未經誘導組明顯減少，相鄰細胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，細胞核質比例明顯降低，胞質內有細小的顆粒樣結構、且多聚集于細胞核周圍，大約30%左右細胞胞質內可見細絲樣結構。對照組未見肌管狀細胞出現(xiàn)。

2．2 hUC MSCs免疫組化鑒定結果 經免疫組化試劑鑒定，誘導組細胞均能著淺褐色，即cTnI表達為陽性，對照組細胞未能著色，即cTnI表達為陰性。

3 討論

最近研究表明，應用MSC移植有可能取代受損心肌細胞并建立新的血管來改善供血及心功能，從而為心肌梗死的治療開辟了一條嶄新途徑。

目前MSC的主要來源為成人骨髓和胎兒臍帶血，但成人骨髓MSC數(shù)量級增殖分化潛能隨供者年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且采集需行骨髓穿刺，來源受到限制［4］。臍帶來源廣泛，便于取材，對供者無不利影響，無倫理道德問題的限制，且細胞增殖、分化能力較強，適合體外大規(guī)模培養(yǎng)。因此，hUC MSCs有望成為骨髓MSC的理想替代來源。

目前用于臍帶源間充質干細胞的培養(yǎng)組織主要是臍帶 Wharton膠和臍靜脈［5，6］，獲取方法主要有酶消化法、組織塊法等。本研究初步建立了臍帶Wharton膠組織塊法培養(yǎng)和用5-aza誘導hUC MSCs體外定向分化為心肌細胞的實驗體系，5-aza誘導3～4周，相鄰hUC MSCs細胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，大約30%hUC MSCs細胞質內可見細絲樣結構。肌鈣蛋白是心肌細胞中的一種調節(jié)蛋白，參與調節(jié)收縮蛋白的舒縮活動，由3個亞單位組成，cTnI是其中之一，hUC MSCs經5-aza誘導分化后，cTnI免疫組化染色陽性，與文獻［7］報道一致，提示分化后的細胞已經合成了心肌所特有的物質，表明hUC MSCs在體外誘導分化為心肌細胞，為今后細胞移植治療心肌梗死提供了實驗依據(jù)。

［1］Si YL，Zhao YL，Hao HJ，et al．MSCs:biological characteristics，clinical applications and their outstanding concerns［J］．Ageing Research Reviews，2011，10(1):93-103．

［2］Parekkadan B，Milwid JM．Mesenchymal stem cells as therapeutics［J］．Annual Review of Biomedical Engineering，2010，12(1):87-117．

［3］Motaln H，Schichor C，Lah TT．Human mesenchymal stem cells and their use in cell-based therapies［J］．Cancer，2010，116(11):2519-2530．

［4］Yu JM，Wu X，Gimble JM，et al．Age-related changes in mesenchymal stem cells derived from rhesus macaque bone marrow［J］．Aging cell，2011，10(1):66-79．

［5］Troyer DL，Weiss ML．Wharton＇s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population［J］．Stem Cells，2008，26(3):591-599．

［6］Kestendjieva S，Kyurkchiev D，Tsvetkova G，et al．Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord［J］．Cell Biol Int，2008，32(7):724-732．

［7］ Roura S，F(xiàn)arre J，Galvez C，et al．Umbilical cord blood-derived stem cells spontaneously express cardiomyogenic traits［J］．Transplantation Proceedings，2007，39(7):2434-2437．