HMBA對人食管癌細胞核基質蛋白表達的影響

楊海波，李 昌，陳蘭英，阮鵬飛，高升

(河南城建學院生物工程系，河南 平頂山 467044)

研究表明，腫瘤細胞中核基質的組成和構型與正常細胞有顯著的差別［1］。2010年6月～2011年2月，我們采用環六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)誘導人食管癌EC9706細胞分化，觀察了分化過程中細胞核基質蛋白表達的變化，旨在探討食管癌細胞分化及其基因表達的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細胞EC9706由鄭州大學基礎醫學院楊勝利教授贈送。HMBA購自Sigma公司，尿素、硫脲、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、二硫蘇糖醇、甲基磺酸鹽購自上海生工公司，兩性電解質購自Pharmcia公司。所有溶液均用Milli-Q水配制［2］。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 人食管癌EC9706細胞培養在內含15%熱滅活小牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、50 μg/ml 卡那霉素RPMI-1640培養液中，培養液 pH 7.2 ～7.4，37 ℃恒溫培養，細胞接種24 h后分為對照組和觀察組，對照組換上新鮮培養液，觀察組換上含5 mmol/L的HMBA作用液進行誘導處理，誘導處理5 d后收獲備用［3］。

1.2.2 核基質蛋白提取 兩組均加入細胞骨架提取液CSK100(10 mmol/L PIPES，300 mmol/L蔗糖，100 mmol/L NaCl，3 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L PMSF，0.5%TritonX-100)0 ℃放置10 min，400 g 離心5 min，去除上清液。加入細胞骨架提取液CSK 50(10 mmol/L PIPES，300 mmol/L蔗糖，50 mmol/L NaCl2，3 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L PMSF，0.5%TritonX-100)洗滌2次，離心，去除上清液。加入300 U/mL DNaseⅠ(CSK 50配制)消化30 min，加入1 mol/L(NH4)2SO4至終濃度 0.25 mol/L，室溫沉淀15 min，1000 g離心5 min，最后 CSK 50洗1次，于－80 ℃儲存備用［3，4］。

1.2.3 核基質蛋白表達檢測 采用雙向凝膠電泳法。①雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳:制備管膠直徑2 mm，長14 cm。核基質蛋白樣品加入裂解液(7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，50 mmol/L DTT，2% 兩性電解質，pH 3.0 ～9.5)，冰浴超聲 2 min，4℃ 16000 g離心30 min，上樣量100 μg，電泳600 V 16 h，1000 V 1 h，等電聚焦電泳結束后，膠條在平衡緩沖液(5%SDS，50 mmol/L DTT，10% 甘油，0.65 mmol/L Tris，pH 6.8，痕量溴酚藍)中平衡 20 min，轉移到1 mm厚13%的SDS-PAGE上部，以1%瓊脂糖封閉，250 V恒壓下，電泳至溴酚藍到達凝膠的底部。進行銀染，采用GDS 8000pc凝膠成像分析系統掃描，經PDQuest軟件分析差異點。②圖像分析:采用凝膠圖像分析軟件PDQuest 8.0(Bio-Rad)行蛋白點的檢測、匹配、定量、標準化及統計學分析。兩組細胞的核基質蛋白電泳各有三處重復，按每個蛋白點的密度相對于整張凝膠總密度的比值對各蛋白點行標準量化，消除上樣量差異，選取表達水平相差2倍以上的蛋白點。

2 結果

兩組雙向電泳凝膠圖譜的匹配率均為80%以上，分別檢測到大約132個蛋白點，其中15個蛋白質點具有明顯差異，兩組大多數核基質蛋白分布情況相似，僅少數蛋白表達發生改變。依據分析的先后順序對上述15個核基質蛋白點編號。其中NMP-5、8、12、13、14 僅在觀察組中表達;NMP-1、2、3、4、6、7、9、10、11、15，兩組均有表達，但觀察組 NMP-7、11、15 表達明顯減弱，NMP-1、2、3、4、6、9、10 表達則顯著增強。

3 討論

核基質是真核細胞核內的纖維網架結構，不僅對于維持細胞核形態、DNA復制、轉錄、RNA加工修飾、基因表達調控等方面有重要作用［5～7］，且還參與調控細胞的增殖、分化與凋亡等生命活動［8］。

本研究采用HMBA誘導人食管癌EC9706細胞分化，共發現15個差異表達的核基質蛋白。其中NMP-5、8、12、13、14 為經 HMBA 誘導處理后新出現的蛋白質，而NMP-7、11和15在EC9706細胞表達較強的蛋白誘導處理后明顯減弱，提示這些蛋白的表達與EC9706細胞的增殖及其惡性程度有重要關系。NMP-1、2、3、4、6、7、9 和 10 在 EC9706 細胞中表達較弱，在HMBA處理后細胞中其表達明顯增強，提示這些蛋白的出現和表達增強對于EC9706細胞的分化及其惡性表型的逆轉起了重要作用。本研究證實人食管癌EC9706細胞誘導分化過程中伴有核基質蛋白表達的差異;與腫瘤細胞增殖分化相關的特異性核基質蛋白的存在，初步從分子水平印證了核基質與癌細胞分化和逆轉的重要關系。進一步分離純化和鑒定上述核基質蛋白，深入研究其在基因表達調控和細胞信號轉導中的作用，對于揭示核基質蛋白與細胞癌變和逆轉的關系，闡明細胞增殖分化的基因表達調控原理，均具有十分重要的意義［9，10］。

綜上所述，深入研究這些在誘導分化處理過程中發生變化的核基質蛋白，不僅可為相關疾病的診斷及治療靶點提供重要的依據，亦可為腫瘤細胞誘導分化機理的研究提供重要的切入點。

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