惡性血液病感染患者血清TLR4表達及臨床意義

馮振軍，趙春亭，李光耀

(1青島大學醫學院，山東青島266003;2青島大學醫學院附屬醫院;3聊城市人民醫院)

TOLL樣受體(TLRs)是人體內天然免疫系統中的細胞跨膜受體，也是原模式的識別受體，TOLL樣受體通過識別病原微生物的特殊結構來迅速激活天然免疫，誘導獲得性免疫的產生［1，2］。其中 TLR4 在膿毒血癥中的表達已有較多報道，多認為TLR4表達與膿毒血癥的病原識別、抗炎免疫信號啟動及轉導等相關，同時介導了組織損害。2009年11月～2011年3月，我們檢測了45例惡性血液病患者不同菌種感染后TOLL樣受體4(TLR4)的表達，探討TLR4對惡性血液病臨床感染的診斷意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 45例惡性血液病感染患者(觀察組，化療后處于緩解期)男31例，女14例;年齡21～78歲。其中淋巴瘤18例，骨髓瘤27例。感染部位:肺部感染19例，肛周感染8例，腸道感染8例，口腔感染10例。惡性血液病均符合《血液病診斷與療效標準》［3］;感染條件:有感染癥狀、體征，體溫＞38℃超過2 h。血培養或分泌物(尿及大便)分離出病原微生物或血液中檢測到病原體的抗原物質。觀察組革蘭陰性菌感染16例，革蘭陽性菌感染9例，真菌感染4例。選取查體健康者5例(對照組)，兩組一般資料有可比性。

1.2 血清TLR4檢測 兩組均取外周血，EDTA-K2抗凝，4℃冰箱保存待檢。檢測時均取100 μl標本加入到20 μl抗體組合為CD14-FITC/TLR4-PE的專用流式試管中?；靹颍覝乇芄夥跤?0min。加2 ml溶血素，室溫避光孵育10min，1 500 r/min離心5min，倒去上清，加入2 ml緩沖液洗滌，1 500 r/min離心5min，去上清，加入100 μl沖液。上流式細胞儀檢測，以CD14及TLR-4抗體染色雙陽性細胞百分率記錄結果。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量數據均以±s表達，兩組均數比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

對照組TLR-4陽性率為41.2% ±0.8%。不同致病菌感染者TLR-4的表達:革蘭陰性菌、陽性菌及真菌感染者陽性率分別為 70.4% ±2.5%、41.2% ±1.3%、40.5% ±2.0%，革蘭陰性菌感染者與對照組及其他菌種感染者比較，P均＜0.05。不同感染部位TLR-4的表達:肺部、肛周、腸道、口腔部位感染者TLR-4陽性率分別為62.2% ±11.3%、49.7% ±2.5%、50.1% ±2.9%、46.9% ±2.3%，以肺部感染者陽性率最高，與對照組相比，T=－4.081，P=0.001;而口腔、肛周與腸道感染者TLR-4水平無顯著差異。革蘭陰性菌感染者治療前TLR4陽性率為70.4% ±2.5%，體溫控制3、7 d后T分別為62.3% ± 3.3%、44.9% ± 1.5%，治療前后比較，P 均 ＜0.01。

3 討論

惡性血液病患者感染發生率高，確定致病微生物對指導臨床治療有重要意義。病原相關分子模式(PAMP)是病原對人體致病的重要分子結構，通常是一定類別病原微生物所共有的、高度保守的分子結構。研究證實，病原相關分子模式的特征:①為一定病原微生物所特有，區別于其他微生物結構;②為微生物在人體內生存和致病所必需;③為宿主泛特異性識別的分子基礎。而在人體對PAMP識別的、分子結構為TOLL樣受體(TLRs)，是一類固有免疫系統中跨膜受體，TOLL樣受體主要在固有性免疫系統細胞表面表達，如單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞等?，F有研究已經證實，TRL4在機體抵抗革蘭陰性菌入侵的先天免疫中有重要作用。細菌內毒素/脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌的主要致病結構及分子基礎。

LPS位于革蘭陰性菌細胞壁的外層，包括三個部分，即O特異性鏈、核心多糖和類脂A。其毒性部分是類脂A，與細菌致病有關。LPS作用人體的生物學效應包括:①與機體組織結合直接導致細胞損傷，刺激單核-巨噬細胞系統等釋放炎性介質、酶等;②作用于凝血、纖溶系統激發播散性凝血;③可激活補體和B細胞;④發熱、休克、致耐藥性和致死性等。研究認為，革蘭陰性細菌在進行活體繁殖或崩解時可釋放內毒素或LPS［6］，從而引起全身毒性反應。在機體內，LPS介導的免疫信號的激活需要血漿或細胞表面和內毒素結合的蛋白作為載體，而TRL4正是介導人體內LPS誘導免疫細胞激活的敏感受體。LPS通過一定途徑進入人體后，首先進入血循環，與血漿的LPS結合蛋白(LBP)識別并結合，之后再結合于單核等介質細胞表面的CD14分子［7］。CD14通過 GPI錨定于單核細胞膜。LPS以LPS2-LBP2-CD14形式的三體復合物活化TLR4信號傳導。結合于TLR4胞外區的MD22是一種可溶性蛋白分子，通過與TLR4結合來提高對LPS的敏感性，并可增加結構的穩定性。研究發現，TLR4基因缺失鼠分離的巨噬細胞和B細胞對LPS低敏，說明LPS信號轉導需要TLR4的參與;轉染人類TLR4基因的293細胞，可以被LPS2CD14呈劑量及時間依賴性活化，引起NF2κB及其控制的相關基因的激活和表達［8］。

根據以上作用模式，現代免疫學認為，TLR4是人體內LPS作用的優先受體，TLR4作為細胞膜上LPS的信號成分參與LPS的細胞激活，并可介導LPS對人體的免疫損傷。本研究發現，惡性血液病患者TLR4的基礎水平與健康人并無區別，認為盡管此類患者存在免疫功能缺陷，臨床上對感染易感，但在病原微生物的識別上與免疫功能正常的人群無顯著差異，其免疫功能降低可能存在于免疫信號的轉導或效應階段。本研究亦發現，革蘭陰性菌感染者TLR4陽性率明顯升高，而在臨床抗感染治療好轉后，其TLR4的表達又明顯下降，說明TLR4的表達與革蘭陰性菌感染密切相關。TLR4的檢測對革蘭陰性菌感染具有一定的判定意義。LPS對各種細胞TLR4表達的影響與作用時間和作用濃度有關，并有種系特異性和組織細胞特異性，作用機制可能比較復雜。但是可以看出LPS對TLR4表達的影響以上調為主。本研究革蘭陰性菌感染者，TLR4的表達出現明顯上調，屬于機體對外界感染的防御性機制。

TLR4的表達和功能對機體的天然免疫系統和獲得性免疫系統在感染的控制具有重要作用。TLR4表達的調節可能是一把雙刃劍，一方面其在宿主抵御微生物入侵方面有重要作用，作為感受器在病原入侵時激發機體的免疫反應;另一方面其作為機體內源性毒性信號的受體，可進一步導致組織損害。本研究肺部感染患者TLR4陽性率顯著升高，臨床感染癥狀相對較重，抗感染效果較差，恢復時間較長，說明重癥革蘭陰性菌感染病例可能已經合并嚴重的內毒素血癥，機體免疫調節功能出現紊亂，TLR4表達上調對其抗感染免疫起了負面作用。

綜上所述，TLR4在惡性血液病革蘭陰性菌感染，尤其是肺部感染時廣泛表達，對臨床診斷有一定參考價值。

［1］Mcdzhilov R，Presion P.A human homologue of the Drosophlia Toll prolcin signals activation of adaptive immunity［J］.Nature，1997，388(6640):394-397.

［2］張燕香，魏蓉.惡性血液病合并感染臨床分析［J］.中國感染控制雜志，2009，8(4):255-257.

［3］中華內科雜志編輯委員會.血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標準與治療原則(草案)［J］.中華內科雜志，2005，44(7):554-556.

［4］Medxzhitov R，Paula PH，Charler A，et al.A Human Homologue of the drosophila toll protein signals activa2tion of adaptive imunity［J］.Nature，1997，388(2):394-397.

［5］Poltora KA，He X，Smirnoval I，et al.Defective LPS signaling in C3H/H eJ and C57BL/10ScCr mice:mutations in Tlr4 gene［J］.Science，1998，282(4):2085-2088.

［6］方文惠.細胞膜脂多糖受體CD14研究進展［J］.國外醫學:免疫學分冊，1998，21(5):246.

［7］Mitsuhiro F，Masashi M，Kenichi T.Molecular mechanisms of macrophage activation and deactivation by LPS:role of the receptor complex［J］.Pharm Ther，2003，100(6):171-194.

［8］Chow JC，Young DW，Golenbock DT，et al.Tissue expression of human Toll like receptors and differential regulation of Toll-like recetoor mRNAsin leukocytes in response to microbes their products and cytokines［J］.Biol Chem，1999，178(5):274-276.

［9］Tsujimoto H，Ono S，Majima T，et al.Differential Toll-likereceptor expression after ex vivo lipopolysaccharide exposure in patients with sepsis and following surgical stress［J］.Clin Immunol，2006，119(122):185-187.

［10］Poltorak A，He X，Smirnova I，et al.Toll-like receptor 3 promotes cross-priming to virus-infected cells［J］.Science，1998，282(5396):2085-2088.