拷問誘導多能性干細胞的應用前景

任 賀，張 磊

(1天津醫科大學附屬腫瘤醫院，天津300060;2細胞產品國家工程研究中心)

誘導多能性干細胞(iPS細胞)是指通過特定基因的表達將完全分化的成年細胞重新編程為類似胚胎狀態的全能性或多能性的細胞。2006年，日本的Yamanaka研究小組首次報道利用逆轉錄病毒將4種轉錄因子組合導入已分化的小鼠纖維母細胞中，獲得iPS細胞［1］。由于iPS細胞繞開了胚胎干細胞(ES)研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙而受到科學家們的青睞，引發了研究熱潮。2007年Science、Nature和Times等雜志均以iPS細胞逆轉“生命時鐘”為名將其評選為年度十大科學突破。

iPS技術被認為是干細胞研究領域的一個里程碑式的突破，同時被認為具有巨大的潛在應用價值［2，3］。理由如下:①iPS技術繞開了ES細胞研究面臨的倫理和法律等障礙，被視為具有廣闊的醫療應用前景;②利用iPS技術能夠獲得患者或疾病特異的多能性干細胞，可以避免移植過程中的免疫排斥問題;③利用iPS細胞向相應疾病中的功能細胞定向誘導的技術，可以建立病理模型用于研究疾病的發病機制，對現有藥物進行個體化的評估，并發現新的治療靶點以及篩選新的藥物。以至于世界第一只體細胞克隆動物Dolly羊的培育者Ian Wilmut也宣布放棄人類ES細胞克隆研究，轉向iPS細胞研究。

科學與技術的目標實現路徑和價值取向有很大不同，當iPS細胞在科學界普遍受到追捧時，我們需要冷靜思考其應用價值與前景。一般來說，一種新的醫藥手段在被應用于實踐之前除了要解決有效性、法規、倫理問題外，還必須具備質量可控性、安全性，和通過必要的技術可行性與經濟可行性評估。隨著iPS細胞研究的深入，其致瘤性和表觀遺傳缺陷帶來的一些問題漸漸浮出水面。本文從以下幾個方面對iPS細胞的應用前景提出質疑。

1 iPS細胞真的可以替代ES細胞建立病理研究模型?

傳統上臨床醫學和藥學采用動物模型來研究多種疾病的病理改變、疾病機制、藥物篩選、藥物安全性和有效性評價等，但由于物種之間的生物學差異使得很多疾病狀態無法很好地用動物模型來模擬。利用ES細胞的定向誘導可模擬某些人類疾病更直接的病理表型，限于ES細胞的來源問題，iPS技術提供了直接從患者獲得所需的研究材料似乎較理想的手段，還可以提供個體化治療方案選擇。

雖然iPS建立體外病理模型有一定的方便性，但iPS細胞被證明帶有自身的表觀遺傳印記和端粒異常，與ES細胞相比iPS細胞中數百個基因存在異常表達［4～6］。因此，iPS細胞是否能夠替代ES細胞復制不同疾病種類和病理特征?同時，不同來源和質量參差不齊的iPS細胞是否已經帶有不期望的疾病表型?iPS技術的誘導去分化和定向誘導方案的外源性影響是否會改變細胞表型或影響疾病特征?

2 iPS細胞臨床應用是否能夠通過系統的安全性評價?

“畸胎瘤實驗”是檢驗細胞重編程的金標準，自從iPS細胞誕生就有人指出是“人造腫瘤”。然而，困擾iPS細胞安全性的問題還遠不止這些，利用逆轉錄病毒整合基因操控具有潛在危險;iPS技術將已進入死亡程序的成體細胞永生化，是一種畸變的“非自然”細胞;處于“年輕”狀態的iPS細胞其實并沒有完全脫胎換骨，被證明在定向誘導分化過程中會發生“出軌”，分化方向赫然指向原初組織，保留起始細胞“記憶”［7］;自體細胞不發生免疫排斥曾是iPS個體化治療的殺手锏，但近期研究表明自體iPS分化細胞也會引起免疫排斥［8］;另外，iPS細胞個體化治療方案的細胞供體和受體是同一患者，如果患者某些基因出現了問題，自體iPS細胞也可能攜帶同樣疾病基因，拿帶有病態基因的細胞能否給患者治病?

iPS細胞安全性問題往往不是在有限時期內能夠判斷的，并不健康的Dolly羊和iPS小鼠似乎在訴說細胞重編程技術“將發育時鐘撥回”不一定是真正意義上的“返老還童”，或許是從“小大人”直奔“老年”?

3 iPS細胞應用技術或產品開發是否具有可操作性?

供臨床用的細胞要求盡可能避免過多的體外操作，iPS要經歷“分離、純化、擴增、誘導去分化、篩選、建庫、擴增、誘導定向分化、篩選、擴增、細胞制備、傳輸、復蘇、配制”等體外過程復雜而又漫長;細胞世代數過高會對細胞的遺傳穩定性、表觀遺傳特性和生物學特性都構成了極大的不確定，細胞衰退或惡變的機會大大增加;去分化、誘導分化及篩選操作效率低下，周期漫長，過程難以控制;如果誤將未分化、不完全分化、不正常分化細胞植入患者體內就意味著威脅;iPS的體外操作過程中需要使用病毒、生長因子、抗體、酶、動物血清、抗生素等多種外源因子，給過程及制品質量控制帶來空前的難度;iPS僅僅解決了ES采集時的倫理問題，而iPS細胞本身的倫理問題并不止這些;iPS細胞應用技術或產品開發是否具有可操作性呢?

4 iPS技術是否可以掙脫被替代的命運?

技術日漸成熟的間充質干細胞(MSC)被證明具有向三胚層組織分化的潛能，有望實現當初對iPS細胞的諸多愿望，在美國MSC產品在糖尿病、移植物抗宿主病、克隆氏病等疾病的治療已進入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床研究;ES細胞的臨床研究也已在多個國家被批準進入臨床觀察;而近期興起的細胞直接轉分化技術的實現更使iPS技術的應用陷入多此一舉的尷尬境地;然而，除此之外，干細胞治療的其他明星們尚未悉數登場。

其實，我國學者趙春華等［9］早在2004年就從多種組織中分離和培育出了亞全能干細胞，并證實它們都具有相同的細胞表型特征以及能夠向三個胚層多系統分化為各種成熟組織細胞;2006年，美國的Ratajczak研究小組［10］也證實成體組織中存在一種微小類胚胎干細胞(VSEL cells)，VSEL干細胞可以被看作是原始胚芽細胞中的一個休眠群體，這類干細胞具有多能干細胞的多種細胞標志因子，可分化為骨骼、肌肉、心臟、神經細胞、肝臟、腸上皮、皮膚上皮細胞和胰腺等組織;2010年日本科學家［11］在人的皮膚和骨髓中發現了能夠發育成人體各種組織和臟器的多系分化持續應激細胞，且不管這些干細胞名頭如何變，既然具有三胚層分化能力的“萬能干細胞”在成體組織內廣泛存在，其安全性方面無疑優于“人工誘導”的細胞，那么，還有沒有必要繼續開發以臨床應用為目的人工重編程iPS細胞?

此外，一些證據表明干細胞移植主要是通過“旁觀者效應”發揮作用，對于多種疾病來講，并不一定或者根本不要將干細胞在體外誘導分化出特化細胞進行移植，體內微環境的改變可激活內源性干細胞進入細胞周期和定向歸巢。人工胞外基質(aECM)或人工干細胞壁龕(Artificial niches)等有望實現未來干細胞治療不植入外源干細胞(cell-free)。

5 iPS應用技術過度投資是不是一種資源浪費?

開展iPS研究的初衷是“尋找合乎倫理道德的胚胎干細胞替代品”。iPS細胞研究的貢獻在于改變了細胞發育的時空順序，可以解釋一些重要的科學規律，對豐富人類對生命的認識和理解癌癥發生的機理具有科學貢獻，但事實上，iPS技術既不能完全替代ES細胞作為病理研究模型，更不能為臨床應用提供足夠安全的、質量可控的和技術經濟可行的干細胞解決方案;科學探索無禁區，在社會經濟條件能夠承受情況下做適當的投入是無可非議的，但在iPS尚不具備轉化成臨床應用技術或產品的條件下，目前階段在iPS產業轉化領域過多的投入或許是一種資源浪費。

［1］Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126(4):663-676.

［2］Nishikawa S，Goldstein RA，Nierras CR.The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(9):725-729.

［3］Gekas C，Graf T.Induced pluripotent stem cell-derived human platelets:one step closer to the clinic［J］.J Exp Med，2010，207(13):2781-2784.

［4］Gore A，Li Z，Fung HL，et al.Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2011，471(7336):63-67.

［5］Hussein SM，Batada NN，Vuoristo S，et al.Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency ［J］.Nature，2011，471(7336):58-62.

［6］Lister R，Pelizzola M，Kida YS，et al.Hotspots of aberrant epigenomic reprogramming in human induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2011，471(7336):68-73.

［7］Kim K，Doi A，Wen B，et al.Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2010，467(7313):285-290.

［8］Zhao T，Zhang ZN，Rong Z，et al.Immunogenicity of induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2011，474(7350):212-215.

［9］趙春華，房伯俊，韓欽，等.亞全能干細胞群生物學特性及移植應用研究［J］.微循環技術雜志:臨床與實驗，2004，8(5):345.

［10］Kucia M，Reca R，Campbell FR，et al.A population of very small embryonic-like(VSEL)CXCR4+SSEA-1+OCT-4+stem cells identified in adult bone marrow［J］.Leukemia，2006，20(5):857-869.

［11］Kuroda Y，Kitada M，Wakao S，et al.Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations［J］.Proc Nati Acad Sci U S A，2010，107(19):8639-8643.