髓樣分化蛋白2對重癥急性胰腺炎的影響

孫 寧，葛春林

(中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽110005)

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌(G-)細胞壁的主要成分，它能被Toll樣受體4(TLR4)所識別，并且TLR4是LPS跨膜信號轉導的主要受體。已有研究表明，TLR4的表達在發生胰腺炎的胰腺中存在上調趨勢，且急性壞死性胰腺炎時，肝、肺等組織中TLR4 mRNA的表達明顯增強［1］。所以，在SIRS和早期MODS，TLR4受體的激動即可被認為是誘導炎癥反應失控的最初因素之一。本文主要就髓樣分化蛋白2(MD2)在TLR4信號轉導過程中的重要作用，及在其誘導下產生的炎癥反應對重癥急性胰腺炎(SAP)的影響和臨床意義加以闡述。

1 MD2的發現及結構特點

1999年，Miyake發現了一種能夠協同TLR4信號轉導的蛋白質——MD2，它由160個氨基酸組成，是一種分泌型糖蛋白，因為其N端有一段由16個氨基酸殘基組成的信號肽，使其具有分泌功能。除此之外，MD2還可以和TLR4在內質網/高爾基體結合，或直接可以表達于細胞表面，不僅能與TLR胞外區結合促進細胞對LPS的反應，而且還能直接與LPS結合，引發炎癥反應，是TLR4的重要輔助分子。

國內外均有研究證明，MD2的氨基酸序列上有兩個糖基化結合位點，分別是Asn26和Asn114，雖然當糖基化位點突變后，MD2仍可表達于細胞表面并與TLR4結合，但對于輔助TLR4引起的核因子κB(NF-κB)的活化功能卻明顯減弱，所以MD2糖基化位點突變的細胞在LPS刺激后只能引起細胞輕度的活化［2］。

2 MD2與TLR4、LPS的聯系

2.1 與TLR4、LPS的結合 有研究證明，MD2存在TLR4和LPS兩個相對獨立的結合區，分別是C2末端的LPS結合區，N2末端的TLR4結合區［3］。在前者，MD2可以直接與LPS結合形成MD2-LPS復合體，再與TLR4結合，形成MD2-LPSTLR4復合體;在后者，MD2與TLR4結合形成MD2-TLR4復合體后，在CD14呈遞下，與LPS結合，形成MD2-TLR4-LPS復合體。這就說明:MD2可以直接與LPS結合，但如果TLR4要與LPS結合，則另需要先與MD2結合形成復合物并要經過 CD14轉導［3］。

近年來的研究還發現:MD2與TLR4的胞外區結合，定位于細胞表面，增加TLR4對LPS的反應性并增強信號轉導強調，然而僅轉染TLR4或是TLR4-CD14的細胞，均未發現TLR4與LPS結合［4］，另外，轉染了 TLR4基因的 HEK293細胞也不能被LPS-CD14激活，也不能引起NF-κB的活化。可是如果當MD2-TLR4-CD14共同表達時，就能檢測到TLR4與LPS結合，同樣也發現:當轉染了MD2和 TLR4基因后的HEK293細胞在受到LPS-CD14刺激時出現NF-κB的活化［5］，活化后的NF-κB能夠引起前炎癥基因轉錄，從而導致級聯反應擴大，最終造成胰腺持續壞死和多臟器功能障礙。

這些都說明了 TLR4不能與 LPS直接結合，MD2是TLR4必需的輔助因子，TLR4必須在MD2的參與和CD14的呈遞下，形成MD2-TLR4-CD14復合物后，才能進一步形成MD2-LPS-TLR4復合物，從而介導免疫信號傳遞，誘發炎癥反應。

2.2 促進TLR4的表達 TLR4必須有MD2的幫助才能識別LPS，單獨轉染TLR4的HEK293細胞不能產生反應，而合并有MD2轉染的細胞則顯示出很好的反應性［6］，說明MD2能夠促進TLR4的表達。MD2的基本功能之一就是與TLR4結合，形成MD2-TLR4，這種復合體為TLR4提供了足夠的結合位點，從而易化了TLR4的級聯反應，并且當MD2與TLR4共同轉染時，在細胞內的TLR4能與聚合程度不同的MD2寡聚體形成特異性結合，多余的MD2分泌入血，在液相中仍然具有活性，使MD2可以產生遠程調控作用［7］。

2.3 影響TLR4在細胞內的分布 Nagai等研究發現:MD2能夠影響TLR4在細胞內的分布。將TLR4轉染至野生型小鼠胚胎成纖維細胞(EF)后，不僅在細胞內有表達，而且在細胞表面也有表達;同時，對照將TLR4轉染至MD2基因缺如的小鼠EF，則只能在細胞內檢測到TLR4的表達，細胞表面幾乎無TLR4表達。

2.4 對LPS信號的調控 已有大量研究證明，LPS能夠直接與MD2結合并發揮作用，而Hyakushima等［6］的研究也證明LPS不能與TLR4單獨結合，需要和細胞表面的MD2-TLR4復合體作用，盡管TLR4與LPS作用后，會發生配體依賴的聚合反應，但是，這種配體依賴的TLR4低聚化和細胞表面MD2-LPS-TLR4復合物的形成幾乎同步，如果缺乏MD2，則這種低聚化就不能發生。

3 MD2在SAP中的表達與組織損傷

通過上述資料我們可以了解到，MD2除了能夠通過促進TLR4的表達、促進TLR4轉導LPS信號而對SAP時釋放炎癥介質產生重要影響外，在一系列信號轉導的過程中，MD2能夠促進NF-κB的活化，這也是影響SAP發生發展的另一重要因素。NF-κB是一類能與多種細胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、黏附分子基因啟動子部位的κB位點結合并增強這些基因轉錄的蛋白質。目前已有多數研究表明NF-κB參與了SAP的發病，那么通過抑制MD2參與的信號轉導通路，從另一方面間接抑制NF-κB的活化，則也可以阻斷促炎因子的產生，對SAP起到治療和保護作用。

在正常情況下，機體能夠通過調節MD2的表達水平來調控LPS信號，但是如果機體內出現如TNF-α和(或)IFN-γ這些炎癥因子能夠刺激MD2表達上調時，LPS信號就可以通過TLR4-MD2復合體傳遞，活化NF-κB從而引起下游信號的瀑布反應，產生大量炎癥介質，造成組織損傷和器官功能障礙。

由于胰腺炎早期主要的病理生理改變是胰腺組織的自身損傷，而這種無菌性炎癥首先激活機體非特異性免疫系統，并通過各種模式識別受體識別病原體相關分子模式，活化單核巨噬細胞系統，從而導致細胞內多種信號反應，釋放比如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 等介質，刺激 MD2 的表達上調。而當病情不斷進展至SAP時，胰腺組織開始由最初的充血、水腫發展至出血、壞死，進而并發胰腺本身及周圍組織的感染(主要是G-菌感染)，啟動特異免疫系統，再次刺激MD2的表達上調，機體分泌大量炎癥介質，級聯反應擴大。這些充分說明了MD2在SAP早期，甚至急性胰腺炎時，就已經參與到這一系列抗感染免疫中，并發揮重要的作用。

4 阻斷MD2的表達實現SAP的早期干預

既然MD2能夠通過促進TLR4的表達、影響TLR4的分布以及促進TLR4與LPS結合，活化NF-κB等輔助手段刺激機體免疫細胞分泌炎癥介質，那么，能否通過阻斷MD2的表達來預防或干預SAP的發生、發展呢?已有研究證明:能與LPS競爭結合MD2的物質能抑制LPS信號的轉導，比如可溶性的TLR4(sTLR4)、可溶性的MD2(sMD2)及LPS的類似物，均能達到抑制炎癥介質產生和釋放的目的，起到減輕炎癥的作用。

Rallabhandi等［8］研究了MD2的表達量對TLR4及LPS信號轉導的影響，發現在HEK293細胞中，隨著MD2轉染量的增加，TLR4的表達量也逐漸增加。而達到峰值后，繼續增加MD2劑量，TLR4的表達反而不再增加，NF-κB活性卻反而降低。說明一定量的MD2可促進TLR4的表達，增強TLR4對LPS的敏感性，但過量的MD2和TLR4-MD2競爭性結合LPS，從而生成MD2-LPS及MD2-TLR4-LPS兩種復合體，與單一復合體存在時相比MD2-LPS和MD2-TLR4-LPS的反應性都很低，而這就在一定程度上抑制LPS信號激活。

另外，在LPS信號轉導過程中，TLR4和MD2結合是重要的一步，可以通過阻止TLR4和MD2結合，達到阻止信號激活的目的。已有研究發現，可溶性的CD14(sCD14)，同樣能夠呈遞 MD2-TLR4與 LPS結合，形成 MD2-TLR4-sCD14-LPS復合體。但這種復合體不能激活正常的細胞反應。所以若能增加sCD14的量，就能夠抑制細胞信號的激活，同樣可以起到減輕炎癥反應的作用。

5 未來研究方向

近年來國內外對于SAP的研究多集中于如何在SAP發病早期即能對其進行正確的判斷以及根據實際情況制定個體化治療方案，如基本的抗感染、抑制胰酶分泌，以及腹腔灌洗和(或)動脈灌注療法、持續的血液透析濾過，甚至腹膜后引流、胰腺及其周圍壞死組織清除術等治療方案上。但是隨著分子生物學的不斷發展，對于SAP在發生、發展及其發生機制特別是其病理生理變化再次成為人們關注的對象。所以，探究在SAP發生、發展、惡化這一系列環節中，到底有哪些細胞因子參與其中，發揮了什么作用，通過什么途徑發揮作用，通過什么干預可以終止這些反應的傳導，進而制定出在SAP早期即可以采取干預手段，就可以減少因為腹腔灌洗或是動脈灌注、手術清創等有創性治療來給患者帶來的痛苦。

MD2的發現和其功能的研究，使我們逐步認識到了它能輔助TLR4對LPS的識別。但是仍有許多問題值得我們進行更深入的研究:對于LPS、TLR4和MD2三者之間更加深層的關系;為什么TLR4不能直接與LPS結合，而當MD2與TLR4結合后，是通過改變TLR4的空間構象還是利用自身的結構特點，使其更易于與LPS-CD14結合;既然大量的MD2可以反過來抑制炎癥反應的發生，那么作為維持機體穩態的一種機制，它究竟在SAP的哪一階段被啟動等等。所以把MD2作為干預SAP早期炎癥反應的靶點，可能會成為一個新的研究熱點，希望能夠通過抑制LPS信號的轉導，減少甚至抑制炎性介質的釋放，從而可以避免炎癥反應的級聯擴大，達到干預SAP進展惡化的目的。

［1］Zhang L，Wu HS，Chen Y，et al.Role of nitric oxide in Toll-like receptor 2 and 4 mRNA expression in liver of acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis rats ［J］.World J Gastroenterol，2006，12(3):485-488.

［2］Ohnishi T，Muroi M，Tanamoto K.N-linked glycosylations at Asn(26)and Asn(114)of human MD-2 are required for toll-like receptor 4-mediated activation of NF-kappaB by lipopolysaccharide［J］.J Immunol，2001，167(6):3354-3359.

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［4］Akashi S，Saitoh S，Wakabayashi Y，et al.Lipopolysaccharide interaction with cell surface Toll-like receptor 4-MD-2:higher affinity than that with MD-2 or CD14［J］.J Exp Med，2003，198(7):1035-1042.

［5］Kirschning CJ，Wesche H，Merrill Ayres T，et al.Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharide［J］.J Exp Med，1998，188(11):2091-2097.

［6］Hyakushima N，Mitsuzawa H，Nishitani C，et al.Interaction of soluble form of recombinant extracellular TLR4 domain with MD-2 enables lipopolysaccharide binding and attenuates TLR4-mediated signaling［J］.J Immunol，2004，173(11):6949-6954.

［7］Gruber A，Mancek M，Wagner H，et al.Structural model of MD-2 and functional role of its basic amino acid clusters involved in cellular lipopolysaccharide recognition ［J］.J Biol Chem，2004，279(27):28475-28482.

［8］Rallabhandi P，Bell J，Boukhvalova MS，et al.Analysis of TLR4 polymorphic variants:new insights into TLR4/MD-2/CD14stoichiometry，structure，and signaling［J］.J Immunol，2006，177(1):322-332.