自體干細胞移植治療糖尿病足胰島功能變化研究

姚秀宇，姚秀松，王 巍，劉艷杰

糖尿病的發病率達10%以上，由此引發的糖尿病并發癥高達30% ～40%［1］，給患者及社會帶來巨大的經濟負擔。骨髓干細胞在一定條件下可以定向分化為機體內的功能細胞，形成多種類型的組織和器官以代替損傷和壞死的組織，從而達到治療疾病的目的［2－3］。目前骨髓間充質干細胞已在體外成功誘導分化為胰島β細胞［4］，許多學者已經找到了體內胰島β細胞分化的相關因素［5］。本研究采用骨髓間充質干細胞治療糖尿病足，同時發現胰島β細胞的功能得到恢復，通過觀察在不同體內環境下，骨髓間充質干細胞向胰島β細胞轉化的程度是否不同，來尋找體內促使骨髓間充質干細胞向胰島β細胞轉化的相關因素，為徹底治愈糖尿病開辟一條新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2005年5月—2010年11月選擇采用骨髓干細胞移植治療的糖尿病足患者125例為研究對象，診斷均符合1999年世界衛生組織 (WHO)制定的糖尿病診斷標準。患者均有足部和 (或)下肢發涼、麻木、疼痛、間歇性跛行;Fontaine分期Ⅱ期80例、Ⅲ期32例、Ⅳ期13例。需要用止痛劑治療13例。以神經病變為主50例，血管病變為主30例，混合型45例。心肌缺血125例均存在，血脂異常100例，腦血栓12例。彩色多普勒檢查顯示各段動脈不同程度的狹窄或閉塞。術前采用胰島素控制血糖，根據血糖控制情況分為兩組;1組為全天血糖完全達標 (三餐前血糖＜5.6 mmol/L，餐后2 h血糖＜7.8 mmol/L)63例，其中男40例，女23例;年齡50～70歲，平均年齡62歲。2組為全天血糖均高于正常(三餐前血糖＜9～10 mmol/L，餐后2 h血糖＜12～16 mmol/L)62例，其中男39例，女23例;年齡50～69歲，平均年齡61歲。

1.2 方法 術前3 d用重組人粒細胞集落刺激因子 (GCSF)300 U/d肌肉注射，作骨髓干細胞動員，當外周血白細胞達 (25～30) ×109/L時，采集骨髓180～200 ml。在手術室絕對無菌的條件下，采用硬膜外麻醉，麻醉生效后，取雙髂后上棘后為穿刺點，常規無菌消毒，鋪無菌手術孔巾，用16號骨穿針多部位抽取骨髓液200 ml。送入我科干細胞分離實驗室。分離后配成一定的濃度，雙下肢多點深部肌肉注射、一部分股動脈內回輸。骨髓單個細胞分離方法:先將骨髓抗凝血用低溫離心機，溫度22℃、1 500 r/min，離心5 min，吸取少許上浮血漿，將單個核細胞層緩慢加入0.077的淋巴細胞分離液中，放入離心機中，1 200 r/min，離心20 min，取出后分為5層，吸取中間層，用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次，配成一定濃度的懸液，回輸。留2 ml干細胞懸液，送學院中心實驗室，用流式細胞儀檢測CD34含量，以推算骨髓干細胞的數量。

1.3 評定方法 觀察患肢的麻木、疼痛感、冷感、間歇性跛行是否好轉，同時檢測術后3 d、1周、2周、1個月、3個月的餐前及餐后2 h血糖、C－肽值，同時觀察外用胰島素用量的變化。觀察有無不良反應發生。

1.4 統計學方法 采用SPSS統計軟件進行數據分析，計量資料采用 (x－±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 125例患者均自訴下肢麻木、疼痛感、冷感、間歇性跛行癥狀明顯好轉。

2.2 手術前后兩組血糖變化比較 術前1組患者餐前和餐后2 h血糖較2組均明顯降低，差異有統計學意義 (P＜0.05);術后3 d、1周、2周、1個月、3個月1組與2組患者餐前及餐后2 h血糖比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表1)。

2.3 手術前后兩組胰島素用量變化比較 術后3 d兩組患者胰島素用量較術前均明顯降低，差異有統計學意義 (P＜0.05)。術前1組患者胰島素用量較2組無明顯降低，差異無統計學意義 (P＞0.05);術后3 d、1周、2周、1個月、3個月2組患者胰島素用量較1組均明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05，見表2)。

2.4 手術前后兩組血C－肽水平變化比較 兩組患者術前、術后3 d、1周、2周、1個月、3個月餐前和餐后2 h血C－肽水平比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表3)。2.5不良反應 兩組患者均無嚴重不良反應發生。

表1 手術前后兩組血糖變化比較 (x－±s，mmol/L)Table1 Comparison of change contrast of blood sugar before and after operation in two groups

表3 手術前后兩組血C－肽水平變化比較 (x－±s，μg/L)Table 3 Comparison of change contrast of blood C－peptide levels in two groups before and after surgery

表2 手術前后兩組胰島素用量變化比較 (x－±s，U/d)Table 2 Comparison of change contrast of the insulin dose in two groups before and after surgery

3 討論

目前在損傷的內分泌胰腺的治療研究中，骨髓來源的干細胞、胚胎干細胞、器官來源的干細胞均有作用［6］。最重要的是如何誘導出具有完全功能的胰島樣細胞，即具有雙相胰島素釋放功能，可以動態模擬生理狀態下的胰島素分泌。目前相關的研究證實，葡萄糖對胰島β細胞的再生有雙重作用［7］，血糖略高于正常時可以促進干細胞分化為胰島β細胞，血糖極高時促使胰島本身的β細胞凋亡［8］。活化的絲－蘇氨酸激酶(PBK)使葡萄糖轉運子定位于β細胞表面，葡萄糖通過轉運子進入細胞內，經酵解使ATP/ADP及磷酸鹽濃度升高，進而ATP依賴的K通道關閉，質膜去極化，電壓依賴式L型鈣通道激活，胞內Ca2+濃度升高促進胰島素分泌。但較長時間的高濃度葡萄糖，又可通過調整不同的基因程序使β細胞產生關鍵表型的改變而致β細胞功能缺陷、去分化及最終致β細胞死亡。對于未分化細胞，葡萄糖可充當有絲分裂劑，有實驗證實，β細胞加入5%～25%葡萄糖，隨濃度上升分裂增殖加快。文獻分析可能由于正常的葡萄糖濃度可使葡萄糖調節基因正常化，恢復葡萄糖調節敏感性，有利于β細胞表型正常化的維持，高血糖在原始細胞階段可誘導干細胞向胰島β細胞分化及胰島素分泌［9］。本研究結果顯示，血糖略高于正常的患者，術后胰島素用量明顯減少，血糖完全正常組胰島素用量減少不明顯，兩組有顯著性差異。兩組術后血糖變化不大，考慮與兩組術前血糖控制差別很小有關，術后兩組血糖均控制在正常范圍，但胰島素用量明顯不同。高糖毒性解除后，胰島β細胞的功能都應有所恢復，術前血糖略高組胰島素用量明顯減少，說明干細胞部分轉化為胰島β細胞。血C－肽值術后兩組均有上升，但無顯著性差異，可能是由于本研究選擇的兩組患者術前均有部份殘存的胰島β細胞。術后兩組餐前、餐后血糖均在參考范圍，是造成術后血C－肽沒有顯著性差異的主要原因。但胰島素用量不同，說明了胰島β細胞恢復的程度不同。高葡萄糖可以誘導干細胞定向分化為胰島β細胞，但對自身的胰島β細胞又有促凋亡的作用，本研究認為最好將血糖控制在略高于正常的水平，有利于干細胞的分化，同時也有利于自身胰島β細胞的修復，對自身干細胞的作用可能是自體干細胞移植時，有部分造血干細胞及相關細胞因子對殘存β細胞有修復作用。研究顯示除葡萄糖外還有許多相關的因素可以促進β細胞分化，文獻報道有尼可酰胺、維甲酸、丁酸鹽類、shh抑制劑、活化素 (Activin)、胰高血糖素樣肽 (GLP)及其類似物等，均可誘導干細胞分化為胰島β細胞［10］，這些因素是否能夠成為干細胞移植后體內轉化的相關因素，有待進一步研究。

綜上所述，干細胞來源廣泛，取材方便，在不同的理化環境下及細胞因子的誘導下具有多向分化的潛能，是組織工程、細胞移植及基因治療領域的理想靶細胞，但體外培養再回輸變數太大，如果可以找到體內誘導的方法，安全系數將明顯提高。

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