生長抑素類似物奧曲肽對人胃癌生長的抑制作用研究

田 蕾，李 舒

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國，胃癌的死亡率占所有惡性腫瘤死亡的23.02%，居各類癌死亡的第一位。盡管大多數胃癌患者應用手術、全身化療等綜合治療，但5年存活率 (20%～30%)仍較低。近年來非細胞毒性藥物治療腫瘤的研究備受關注，其中生長抑素類似物生長抑素在抑制腫瘤生長方面的研究已有很多進展。有研究表明，奧曲肽在體外或動物實驗中能明顯抑制胃癌生長［1］，但有關奧曲肽對人體內胃癌的研究尚少。故本研究通過臨床隨機對照研究，觀察奧曲肽對人體內胃癌生長的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年3月—2009年11月在遼寧醫學院附屬第一醫院接受胃癌根治術或胃大部切除術的50例胃癌患者，術前均做內鏡活檢，并經病理檢查確診為胃癌。其中男35例，女15例;年齡30～72歲，平均 (55.4±10.8)歲，中位年齡為55歲。將患者采用隨機數字表隨機分為兩組:奧曲肽組 (25例)和對照組 (25例)。奧曲肽組中，男18例，女7例;平均年齡 (54.9±10.7)歲;患者對所用藥物充分知情，并同意術前接受奧曲肽治療。對照組中，男17例，女8例;平均年齡 (55.9±10.9)歲;患者同意術前不用任何藥物。兩組患者術前均未經化療或放療。

1.2 方法 奧曲肽組患者術前給予奧曲肽 (諾華公司)100 μg皮下注射，1次/d，共7 d。對照組患者術前不用任何藥物。兩組患者經上述處理后，術中切除標本送組織學研究及免疫組化檢測。

1.2.1 組織學研究 取腫瘤最大橫斷面邊緣、癌進展活躍部位組織，中性甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋。從所取標本中心切片，制備4μm厚的連續切片，HE染色。由病理科醫師在不知分組情況下觀察腫瘤壞死、炎性細胞浸潤及纖維組織增生程度。參照日本 (胃癌處理規約)組織學判定標準以及李國立等［2］方法，觀察切片二維圖像中腫瘤壞死、炎性細胞浸潤及纖維組織增生所占面積大小，將其組織學變化分為3級:輕度變化:≤1/3的癌組織變化;中度變化:＜1/3～＜2/3的癌組織變化;重度變化:≥2/3的癌組織變化。

1.2.2 原位凋亡檢測 用上述切片，采用DNA末端原位標記染色法 (TUNEL)檢測胃癌細胞凋亡。TUNEL試劑盒購自Roche公司。按照說明書進行操作。凋亡細胞呈棕色～黃色，細胞核呈藍色。每張切片選取10個高倍視野 (×400)，每個視野計數100個胃癌細胞中的陽性細胞數，共1 000個細胞，凋亡指數 (apoptosis index，AI)=凋亡陽性細胞數/1 000個胃癌細胞×100%。

1.2.3 免疫組化法檢測組織p63、增殖細胞核抗原 (PCNA)的表達 免疫組化染色采用SP法進行 (鼠抗人p63單克隆抗體及SP試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，主要步驟:4μm切片脫蠟至水;微波熱修復10 min;消除內源性過氧化物酶活性，蛋白阻斷液阻斷10 min，滴加第一抗體，置入4℃冰箱過夜，分別滴加第二、第三抗體，室溫下各孵育10 min，DAB顯色液，蘇木精復染，脫水、透明、封片。

p63、PCNA結果判斷:以細胞核內出現棕褐色顆粒為陽性細胞，高倍鏡下隨機計數10個視野，計數不少于500個細胞進行評分。根據染色程度及染色細胞百分率進行分析評定。首先將染色強度計分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽性細胞所占的百分比計分:0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為11% ～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%。染色強度計分與陽性細胞百分比的乘積＞3分為免疫反應陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件包進行統計分析。兩個樣本率間的比較采用四格表的χ2檢驗，多個樣本率的比較采用趨勢χ2檢驗;計量資料以 (x－±s)表示，3組間的比較采用方差分析;兩個分類變量間的相關采用行×列表的關聯性分析，等級資料采用Mann－Whitney秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術后TNM分期及病理診斷 兩組胃癌患者的腫瘤均原發于胃部。根據TNM分期，50例患者中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期者分別占14.0%(7/50)、46.0%(23/50)和40.0%(20/50)。根據世界衛生組織的組織學分類，50例患者中管狀腺癌46例(92.0%)，印戒細胞癌 4例 (8.0%);高分化 7例(14.0%)，中分化21例 (42.0%)，低分化 (將印戒細胞癌歸為低分化癌)22例 (44.0%)。

2.2 兩組患者胃癌組織的組織學差異 與對照組比較，奧曲肽組出現明顯的胃癌組織壞死，纖維組織增生也顯著增加，兩組間差異有統計學意義 (P＜0.05);兩組胃癌組織炎性細胞浸潤程度比較差異無統計學意義 (P＞0.05，見表1)。

2.3 兩組患者胃癌組織細胞凋亡情況比較 細胞凋亡陽性表達位于細胞核內，呈紅棕色散在分布 (見圖1、2)。定量分析顯示，奧曲肽組胃癌組織腫瘤細胞的凋亡率為 (8.85±1.92)%，顯著高于對照組的 (6.47±1.68)%，組間比較差異有統計學意義 (t=4.664，P＜0.05)。

表1 兩組患者胃癌組織的組織學變化 (例)Table 1 Histologic changes of stomach cancer between two groups

2.4 兩組患者胃癌組織中p63蛋白、PCNA的表達 p63蛋白、PCNA陽性染色主要位于細胞核，為棕褐色顆粒，陽性細胞呈片狀、彌漫或灶性分布 (見圖3～6)。奧曲肽組胃癌組織中p63蛋白及PCNA陽性表達率分別為56.0%(14/25)和52.0%(13/25)，對照組分別為84.0%(21/25)和86.0%(22/25)，兩組比較差異有統計學意義 (χ2值分別為4.667和9.441，P值分別為0.031和0.002)。

2.5 胃癌分化程度與組織學改變、凋亡及p63蛋白、PCNA表達的關系 胃癌分化程度與癌組織炎細胞浸潤、腫瘤壞死、纖維組織增生程度無關，按照胃癌高－中－低分化程度，癌細胞凋亡程度隨之減弱，PCNA、p63蛋白表達逐漸增強 (P＜0.05，見表2)。

2.6 藥物不良反應及并發癥 在本研究治療過程中，兩組均未發現藥物不良反應，也無因腫瘤壞死而出現的嘔血、發熱等并發癥。

3 討論

近年有研究表明，胃癌的發生發展與癌基因激活、抑癌基因失活等因素有關。1998年，Yang等［3］發現了p53的同源基因p63，由于啟動子的不同和剪切方式的不同，p63基因編碼至少6種亞型的蛋白質，可分成兩大類:從外顯子1開始轉錄生成具有反式激活區的亞型稱為全長p63異構體 (TAp63);另一個從外顯子3'啟動子開始轉錄生成沒有反式激活區的亞型稱為截短 p63異構體 (ΔNp63)。p63在 DNA結合結構(DNA binding domain)、轉錄激活結構 (transcriptional transactivation domain)、四聚體化結構 (tetramerization domain)與p53基因的同源性分別達到60%、22%和37%。在DNA結合區，TAp63與p53的同源性高達60%，提示TAp63和p53能夠結合同一DNA位點，從而與同一靶基因結合，如p21、bax。然后在反式作用域 (TA域)的作用下激活下游基因，誘導細胞周期阻滯或細胞凋亡，抑制腫瘤的發生;沒有反式激活域的亞型 (ΔNp63)則不能激活下游基因，以顯性失活的方式促進腫瘤的發生。本研究結果顯示，胃癌組織中p63蛋白陽性表達率為84.0%，且p63蛋白表達與腫瘤的分化程度有關，按照高分化－中分化－低分化的病理表現，p63蛋白表達逐漸增強。提示胃癌中高表達的p63蛋白很可能是以ΔNp63的形式表達，并執行了癌基因的角色，這也闡明了p63蛋白的過表達并沒有阻止胃黏膜病變的發生發展，相反在惡性程度高的胃癌組織中高表達的原因。劉榮等［4］研究發現p63蛋白過度表達參與調控胃癌發生。由此推測，p63蛋白在胃癌的發生發展中起癌基因作用，它們的高表達參與胃癌的發生，p63蛋白高表達可作為臨床早期診斷胃癌的實驗指標。另外，本研究發現經過奧曲肽干預后，表達棕黃色顆粒的陽性細胞數逐漸減少，這證實了奧曲肽能夠抑制p63蛋白表達。其機制可能與奧曲肽與生長抑素受體結合后，上調蛋白酪氨酸磷酸的活性，使酪氨酸激酶去磷酸化而失活，并抑制有絲分裂原激活的蛋白激酶等多種蛋白激酶，從而抑制癌基因 c－fos、c－myc、c－jun等的激活，抑制DNA和蛋白質的合成，從而發揮干擾細胞周期、抗有絲分裂的作用［5］。本研究應用奧曲肽抑制了p63蛋白的表達，從而間接引起胃癌細胞周期阻滯，誘導胃癌細胞凋亡，從而抑制胃癌細胞的生長。

圖1 對照組胃癌細胞凋亡 (Tunel法，×400) 圖2 奧曲肽組胃癌細胞凋亡 (Tunel法，×400)Figure 1 Gastric cancer cells apoptosis in control group Figure 2 Gastric cancer cells apoptosis in octreotide group圖3 對照組p63蛋白的表達 (SP法，×400) 圖4 奧曲肽組p63蛋白的表達 (SP法，×400)Figure 3 p63 protein expression in control group Figure 4 p63 protein expression in octreotide group圖5 對照組PCNA的表達 (SP法，×400) 圖6 奧曲肽組PCNA的表達 (SP法，×400)Figure 5 PCNA expression in control group Figure 6 PCNA expression in octreotide group

表2 兩組胃癌組織的分化程度與治療反映的關系Table 2 The relation of gastiric cancer cells differentiation between the therapy in the two groups

PCNA是一種細胞周期調節蛋白，是細胞DNA合成期必不可少的因子，可作為細胞增殖的標志物，且能確切反映細胞生長速度及狀態。本研究發現，胃癌組織PCNA陽性表達率為86.0%，經過奧曲肽干預后PCNA陽性表達率 (52.0%)顯著下降，且PCNA表達與胃癌的分化程度有關，低分化胃癌組織中PCNA表達顯著高于高中分化胃癌組織，即分化越差，PCNA表達越強，腫瘤細胞的增殖活性越高、腫瘤的惡性程度越高，與文獻報道［6］一致。奧曲肽組PCNA的表達減少，其機制可能為通過抑制蛋白激酶C和c－src活性阻止細胞周期G1/S過渡，阻滯細胞周期，從而抑制胃癌細胞的增殖［7］。

近年來人們開始關注細胞凋亡的減少在腫瘤的發生、發展中所起的作用，認為細胞凋亡的減少是腫瘤發生和發展的重要因素［8］。伍楚蓉等［9］報道胃癌組織細胞凋亡指數低于癌旁組織，在胃癌的發生、發展過程中細胞凋亡受到抑制。因此提示胃癌的惡性生長不僅是癌細胞過度生長所致，癌細胞凋亡被抑制也是其重要原因之一。本研究應用Tunel技術檢測兩組胃黏膜組織的凋亡情況，結果發現奧曲肽組腫瘤細胞凋亡率顯著增加，能明顯促進胃癌患者腫瘤組織壞死和纖維組織增生，從而有效抑制胃癌的生長。其作用機制主要是生長抑素及生長抑素類似物與生長抑素受體 (SSTR3)結合，觸發細胞內酸化，并通過 PTP激活 wtp53和bax基因，導致細胞凋亡［10］。此外，占優勢的ΔNp63α水平的下調可能是誘導凋亡的一個因素［11］。以往一些研究表明，胃癌的腫瘤細胞可表現出對射線、化療、TNF介導的凋亡抵抗，本研究中奧曲肽組降低了腫瘤細胞抗凋亡的作用，提示我們是否可以通過使用其他生長抑素及生長抑素類似物藥物來降低腫瘤細胞耐藥性。

目前手術仍然是胃癌的最佳治療方法，但手術本身可引起一定程度的免疫抑制，導致外周血淋巴細胞減少以及癌細胞微轉移，甚至促進胃癌細胞增生。因此，胃癌術前治療一直受到重視。有文獻報道，對可根治切除的胃癌患者術前給予有效抗腫瘤治療，有助于提高手術切除率［12］。目前，術前抗腫瘤治療多采用細胞毒性的化療藥物，雖在部分病例可抑制腫瘤生長，甚至使瘤體縮小，但化療藥物對骨髓和免疫的抑制可削弱機體對腫瘤酶免疫，術后復發率增加。本研究采用非細胞毒性藥物奧曲肽治療，可明顯抑制胃癌生長，呈現較好的組織病理學反應，且無明顯骨髓抑制。理論上有助于提高手術切除率和存活率，降低復發率。該治療方案若用于術后，可成為防止胃癌復發的手段之一;用于姑息治療，可延緩患者帶瘤生存時間。有關奧曲肽在臨床上的多方面應用，尚需在劑量、療程等方面做進一步的探討。

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3 Yang A，Kaghad M，Wang Y，et al．p63，a p53 homolog at3q27－29，encodes multipe products with transactivating，death － inducing，and dominant negative activities ［J］．Mol Cell，1998，2(3):305－316.

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