二烯丙基二硫對人胃癌細胞維甲酸相關孤核受體α表達的影響

石 鶯，黃建軍，唐章文，譚亞麗，吉曉霞，凌 暉，蘇 琦

二烯丙基二硫 (diallyl disulfide，DADS)是大蒜中主要的脂溶性成分。DADS處理腫瘤細胞后，腫瘤細胞結構及形態學表現有明顯的向正常細胞分化的趨勢［1］。進一步運用蛋白質組學技術研究發現，DADS處理人胃癌MGC803細胞前后，有24種蛋白表達出現變化［2］，其中表達顯著上調的維甲酸相關孤核受體α(RORα)在DADS誘導MGC803細胞分化過程中的作用機制不明。RORα在調節體內多種組織細胞的發育和(或)分化以及對抗疾病的發生發展過程中發揮重要作用［3］。有研究顯示，RORα具有抑制前列腺癌細胞［4］、結腸癌細胞［5］、乳腺癌細胞［6］增殖的作用，但是 RORα與胃癌的關系尚不清楚。故本研究通過觀察DADS對體外培養的人胃癌SGC7901(中分化腺癌)細胞與MGC803細胞形態結構的影響，觀察DADS處理前后人胃癌細胞中RORα蛋白表達的差異，探討DADS誘導人胃癌細胞分化的分子機制以及RORα與胃癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SGC7901、MGC803細胞由中南大學湘雅醫學院細胞中心引進。DADS為Fluka公司產品。核蛋白抽提試劑盒GK5112為上海捷瑞生物公司產品。BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產品，RT－PCR逆轉錄試劑盒為Promega公司產品，總RNA提取試劑盒為美國Omega公司產品，均購于華美生物工程公司。兔抗人RORα多克隆抗體購自Santa Cruz公司，羊抗兔二抗購于武漢博士德生物公司。其他常規的化學用品、新生牛血清、RPMI－1640培養基均購自長沙瑞晶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 所有細胞用含體積分數為10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養于37°C，含體積分數為5%二氧化碳(CO2)的恒溫培養箱中培養。取對數生長期細胞，按所需濃度接種于培養瓶或培養板內，待6～8 h細胞完全貼壁后，加用或換用含有藥物的培養液，培養至預定時間。本實驗中采用30 mg/L DADS濃度作為MGC803處理組的濃度。

1.2.2 形態學觀察 利用倒置顯微鏡對活細胞在接觸處理因素前后細胞形態學及生長狀況的變化進行動態觀察。制備細胞爬片，常規HE染色于鏡下觀察處理前后細胞形態學的改變。

1.2.3 免疫細胞化學染色 制備細胞爬片，預冷丙酮室溫固定10 min，自然風干，4°C冰箱保存。SP法常規檢測，滴加抗體前，切片經高壓處理，修復暴露抗原。以PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色。

1.2.4 間接免疫熒光流式細胞術 常規消化收集細胞，1 000 r/min，離心5 min，計數制成1×109/L×1 ml的單細胞懸液。加4%多聚甲醛1 ml固定細胞，4°C冰箱保存備用。用PBS洗滌離心2次，洗掉固定液，將細胞混勻，加細胞打孔劑0.1% ～0.2%Triton－X 100 1 ml，冰上孵育10 min，PBS洗滌離心2次，分裝成兩個體積基本相等的EP管;加50μl一抗(或PBS代替一抗作為陰性對照)，冰上孵育30～45 min;PBS洗滌離心2次，棄上清液;加50μl熒光標記的二抗 (FITC－二抗)冰上孵育30～45 min;PBS洗滌離心2次，棄上清液;用剩余的PBS重懸細胞，1%多聚甲醛0.5 ml細胞固定，上機檢測，流式細胞儀分析熒光強度。

1.2.5 半定量RT－PCR

1.2.5.1 引物合成 利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，送交上海生物工程服務技術有限公司合成，引物序列如下所示:β－actin:上游引物:5'－TCTACAATGAGCTGCGTGTGG－3'，下游引物:5'－GGAACCGCTCATTGCCAATG－3'(496 bp);RORα:上游引物:5'－GTCAGCAGCTTCTACCTGGAC－3'，下游引物:5'－GTGTTGTTCTGAGAGTGAAAGGCACG －3'(482 bp)。

1.2.5.2 細胞總RNA提取 采用美國Omega公司總RNA提取試劑盒 (E.Z.N.A Total RNA Midi Kit，product#R6693)提取，按照試劑盒說明書步驟操作。1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，并用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。

1.2.5.3 反轉錄 按照RT－PCR試劑盒說明書合成第一鏈cDNA。PCR體系中含有cDNA 2μl，2×Taq PCR Master Mix(0.1 U Taq DNA Polymerase/ml，500 mmol/L;dNTP each，50 mmol/L;pH 8.7的Tris－HCl;20 mmol/L KCl;4 mmol/L MgCl2)10 μl，上游引物 (10 pmol/μl)0.5 μl，下游引物(10 pmol/μl)0.5μl，加無核酸酶的水至終體積為20μl。優化的PCR反應條件為:95°C預變性10 min;94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 s，30個循環;72°C最終延伸10 min。反應結束后取5μl產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用UV觀察EB染色條帶并照相。

1.2.6 Western blot檢測 用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養液培養人胃癌細胞，待細胞生長至對數生長期時，用30 mg/L DADS處理MGC803細胞8、12、24 h后收集細胞，根據核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白;BAC法進行蛋白定量。10%分離膠，以每孔50μg的蛋白量加樣，進行SDS－PAGE電泳。將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，轉移條件為4°C，恒壓100 V，3 h。5%脫脂奶封閉4°C過夜。一抗 (1∶1 000)37℃孵育2 h，二抗37°C孵育1 h。于暗室中曝光，顯影、定影。膠片用薄層掃描儀進行灰度掃描，分析各產物的灰度值(V值)，將各V值與對應標本的Vβ－actin相比，計算出樣本蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件包進行數據處理。計量資料以 (x－±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學觀察結果 MGC803細胞體積大，細胞質相對少，細胞核大，染色深，核仁明顯，可見核分裂象;DADS處理24 h后，細胞大部分變成梭形或小圓形，細胞稀疏，核變小，染色變淡，核仁數量減少，核質比減小。SGC7901細胞呈多邊形或不規則形，細胞致密，甚至堆積為復層，可見瘤巨細胞，核質比例大，核大、深染，核仁多個，可見核分裂象，細胞大小不一，異型性明顯;DADS處理24 h后，細胞皺縮、變圓，體積變小，核仁少見，細胞質比例增大，嗜酸性增強，核分裂象少見，細胞間隙明顯增大 (見圖1)。

2.2 免疫細胞化學檢測結果 RORα陽性染色主要位于細胞核，細胞質中也可見少許陽性染色。以PBS代替一抗作為空白對照，DADS處理前RORα在兩種胃癌細胞中有弱陽性表達，DADS處理24 h后的SGC7901、MGC803細胞中呈強陽性表達 (見圖2)。

2.3 RT－PCR結果 灰度掃描定量分析結果顯示，DADS處理24 h后，SGC7901、MGC803細胞中RORα的表達量分別為(1.09±0.01)和 (0.97±0.01)，顯著高于對照組的 (0.45±0.03)和 (0.44±0.02)，差異有統計學意義 (t值分別為74.81和64.76，P＜0.01)。實驗重復3次。

2.4 Western blot分析 30 mg/L DADS處理人胃癌MGC803、SGC7901細胞8、12、24 h后，RORα蛋白表達量均較未處理組顯著上調，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表1、圖3)。實驗重復3次。

3 討論

前期工作表明:作為大蒜中主要的脂溶性成分，DADS不僅毒性低，抗腫瘤效果明顯，還是一種很有開發潛力的抗腫瘤藥物。用大蒜中主要的脂溶性抗腫瘤成分DADS處理腫瘤細胞后，腫瘤細胞結構及形態學表現有明顯的向正常細胞分化的趨勢［1］;在鑒定DADS處理前后人胃癌MGC803細胞差異表達蛋白的蛋白組學研究過程中發現，DADS處理MGC803細胞后，一些有潛在誘導胃癌細胞分化作用的蛋白如RORα表達顯著上調［7］。一系列研究表明，RORα與體內其他生物活性因子協同作用，共同調節細胞的生長、分化與凋亡［8－9］，對多種組織器官的發育起著關鍵作用。另外，RORα參與生物代謝的調控，在對抗心血管疾病、慢性炎癥、免疫功能不全、骨代謝障礙、腫瘤等一些病理過程中發揮重要作用。

本實驗利用多種方法觀察DADS處理人胃癌細胞前后RORα蛋白表達的變化。發現 DADS處理人胃癌 MGC803、SGC7901細胞24 h后，與對照組相比，兩種腫瘤細胞均出現明顯的形態改變，提示DADS對人胃癌細胞有抑制增殖并誘導細胞向良性或正常細胞方向發展的作用。免疫細胞化學結果顯示，與對照組細胞核內RORα蛋白弱陽性表達相比，DADS處理組細胞核內棕黃色顆粒顯著增多，RORα蛋白強陽性表達。RT－PCR反映了 DADS對人胃癌 MGC803、SGC7901細胞RORα核酸水平表達的影響，其結果說明DADS誘導人胃癌細胞RORα編碼基因的表達上調。Western blot結果顯示，DADS處理人胃癌MGC803細胞8、12、24 h后，RORα蛋白相對表達量較對照組明顯上調。

圖1 光學顯微鏡下DADS處理前后人胃癌細胞的形態 (HE染色，×400)Figure 1 Phase－contrastmicrographs of MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS

圖2 DADS處理前后人胃癌細胞中RORα的表達 (SP法，×400)Figure 2 Expression of RORαin MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS

表1 DADS作用不同時間對MGC803、SGC7901細胞中RORα蛋白表達的影響 (x－±s，n=3)Table 1 Expression of RORα in MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS for 8 h，12 h and 24 h

圖3 DADS處理前后RORα蛋白表達變化Figure 3 Expression of RORαin MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS

綜上所述，DADS能誘導人胃癌MGC803、SGC7901細胞RORα蛋白表達上調，RORα可能是DADS作用的潛在靶點，但RORα在DADS抑制人胃癌細胞增殖作用中的具體作用機制還有待于進一步研究。

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