海藻酸鈉-殼聚糖微球制備及質量評價研究

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(1.吉林大學第四臨床醫院，吉林 長春 130011；2.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117;3.吉林工業職業技術學院，吉林 吉林 132013)

微球是緩控釋新型給藥系統，根據不同的需要可以作為口服劑、注射劑等使用，具有潛在的應用價值，成為國內外醫藥研究和應用的趨勢。制備的微球主要有白蛋白微球[1]、明膠微球[2]、聚乳酸微球[3]等，根據材料性質的不同，可以采用溶劑揮發法[4]、噴霧干燥法[5]等進行微球制備。但是有些材料和制備方法存在一定的弊端，如聚氰基丙烯酸酯等，在體內不容易降解和代謝，在制備過程中多用有機溶劑，如固化劑甲醛、戊二醛等，殘留在制劑中不容易除去，且有些方法在制備過程中需要在高溫條件下進行，對藥物穩定性具有一定影響。本研究采用可生物降解的海藻酸鈉和殼聚糖為材料，制備過程不加有機試劑，并且反應條件溫和。

葫蘆素(cucurbitacin，CU)系從葫蘆科植物甜瓜蒂(PedicellusMelo)提取分離而得，是治療肝炎和肝癌的有效成分,其中主要成分為葫蘆素B(CUB)[6]。為提高藥物的生物利用度、降低毒性作用，將其制備成微球制劑，達到緩釋的作用，本文以其主要藥用成分CU為指標對其載藥量、包封率及體外釋藥進行研究。

1 實驗材料

1.1 儀器 TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司) ；Al204型電子天平 (梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ3200DB型速控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；SHA-CA水浴恒溫振蕩器 (江蘇金壇市精達儀器制造廠)；SZ-1渦旋混勻機(江蘇金壇江南儀器廠)；HJ-5多功能攪拌器(常州日華電器有限公司)。

1.2 試藥與試劑 葫蘆素B對照品(CUB)(純度質量分數為98.85%，購自天津藥物研究院)，甜瓜蒂提取物(本實驗室自制)，殼聚糖(中脫乙酰度75.0～89.0%，批號090303，購自沈陽鑫盛生物科技有限公司)，海藻酸鈉(黏度8mpa.s，批號090312，購自青島晶巖生物科技開發有限公司)，十二烷基硫酸鈉、氯化鈣、香草醛、乙酸、三氯甲烷、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、高氯酸、硫酸均為分析純。

2 實驗內容

2.1 微球的制備 本研究采用滴制法制備海藻酸鈉-殼聚糖微球。將一定量藥物溶解于海藻酸鈉水溶液中，混合均勻，滴入含有一定量氯化鈣的殼聚糖溶液中，并攪拌一定時間取出，蒸餾水洗滌數次，室溫干燥，即得。

2.2 載藥微球的評價

2.2.1 微球形態學特征 干燥前的微球為白色的實體球，表面光滑，具有一定的硬度，正圓形，見圖1。干燥后的微球略顯黃色，顯微鏡下觀察表面有眾多皺紋，微球縮水皺縮所致，見圖2。

2.2.2 微球粒徑及分布 按照微球制備方法制備三批微球，采用顯微鏡測定微球的粒徑大小。隨機取制備的微球適量，測定每個球體三個角度的直徑，防止球體不圓整測量不準，計算微球的平均粒徑和粒徑分布狀況。結果制備3批微球的平均粒徑為342.8 μm，337.6 μm，322.5 μm，平均粒徑為(334.3±10.54)μm，表明微球粒徑大小較均一，粒徑分布較窄，分散性好。

圖1 微球圖片

圖2 微球顯微圖片(×4)

2.2.3 微球的圓整度 在3批微球樣品中，每批微球取出100粒，采用“2.2.2微球粒徑及分布”項下方法測定每1微球3個不同角度的粒徑，計算RSD值。根據微球粒徑的RSD值為微球打分，具體打分標準如下：RSD值=0～2%，圓整度很好，10分；RSD值=2%～4%，圓整度良好，8分；RSD值=4%～6%，圓整度較好，6分；RSD值=6%～8%，圓整度一般，4分；RSD值=8%～10%，圓整度稍差，2分；RSD值>10%，圓整度不好，0分。經測定，微球粒徑的RSD值為3.15%,微球的圓整度良好。

2.2.4 CU含量測定方法學研究

2.2.4.1 CU對照品、供試品溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取CUB對照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制備成1.0 mg/mL的CUB對照品溶液。

供試品溶液的制備：分別精密稱取載藥微球制劑及空白微球各25 mg,加1 mL蒸餾水浸泡30 min，研磨至均勻膠漿，加入2 mL三氯甲烷，漩渦10 min后，3 800 r/min離心10 min,取三氯甲烷層。再次加入三氯甲烷，同上處理，反復3次，合并三氯甲烷層，備用。

2.2.4.2 CU檢測波長的確定 稱取CU成分，采用香草醛-冰醋酸法顯色，紫外分光光度計400～700 nm波長范圍掃描。CU在532 nm處有最大吸收峰，故確定檢測波長為532 nm。

2.2.4.3 CU線性關系的確定 精密吸取CUB對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于容量瓶中，配成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL溶液，采用香草醛冰醋酸反應顯色在532 nm處檢測。以吸光度值(Y)對濃度(X)進行線性回歸，得到回歸方程：Y=0.783 4X+0.031 8(R=0.999 2)，結果表明，CU的檢測濃度在0.1～0.6 mg/mL呈良好的線性關系。

2.2.4.4 精密度實驗 精密吸取CUB對照品溶液0.3 mg/mL，香草醛-冰醋酸反應顯色后，在532 nm處連續測定5次，計算精密度。結果其RSD為0.58%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.5 穩定性實驗 精密吸取CU供試品溶液，香草醛-冰醋酸反應顯色后，532 nm處測定，測定時間分別為10、20、30、45 min，1、2、3、4 h。結果顯示，CU在4 h內測試穩定，RSD值為1.47%。

2.2.4.6 重現性實驗 制備CU供試品溶液5分，精密吸取1 mL，香草醛-冰醋酸反應顯色后，在532 nm處測定，計算RSD值。結果表明供試品溶液重現性RSD=2.07%，樣品重現性良好。

2.2.4.7 回收率實驗 精密稱取15 mg的微球制劑，分別加入1∶0.8、1∶1、1∶1.2 3種濃度的標準品溶液，按照供試品處理方法制備，在532 nm處測定，代入標準曲線求其含量。根據各樣品的加入量，計算其回收率。結果表明，高、中、低3種濃度的回收率分別為96.05%，95.83%，95.94%，RSD值為0.46%，0.52%，0.60%，表明供試品測試的制備方法可行。

2.2.4.8 微球中藥物的含量測定 精密吸取3批樣品的供試品溶液，60 ℃水浴揮干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸，水浴60 ℃反應15 min，冷卻至室溫，加入冰醋酸5 mL，532 nm處測定吸光度值，根據標準曲線法計算含量。空白為空白微球在供試品相同條件下的反應溶液。微球中CU的含量為20.48 mg/g。

2.2.5 載藥量及包封率測定 測定微球中皂苷的含量，按照公式：載藥量%=(微球中藥物的重量/微球重量)×100%，包封率%=(微球中藥物的重量/投入的總藥量)×100%計算載藥量及包封率。結果微球的包封率為78.72%，載藥量為17.50%。

2.3 微球體外釋藥研究 分別精密稱取微球制劑及空白微球各0.5 g置透析袋中，以50 mL pH 7.2的磷酸鹽緩沖液(含5%的十二烷基硫酸鈉)為釋放介質，置于水浴恒溫振蕩器中，控制溫度在(37±0.5) ℃，攪拌速度為50 r/min，于不同時間30 min，1、2、4、6、8、10、22、26、30、34、46、52、60 h)取樣5 mL，同時補充同體積同溫度的釋放介質5 mL。透析樣品按照供試品溶液的制備方法處理，采用香草醛冰醋酸反應檢測透析液中的CU的含量。以取樣時間(t)為橫坐標,累積釋放百分率(%)為縱坐標繪制釋放曲線。對釋放曲線進行零級，一級，Higuchi方程擬合，由擬合方程得知，CU的釋放曲線符合Higuchi方程，制備的微球均具有緩釋作用。結果見表1。

表1 微球體外釋放擬合方程及相關系數

圖3 微球體外釋藥曲線圖

3 結果與討論

3.1 微球的制備方法有很多，一般較為復雜，且多有有機溶劑參與，有的需要在高溫條件下進行制備，對藥物微球的穩定性及使用的安全性具有一定的影響。本實驗制備微球的輔料海藻酸鈉和殼聚糖均為可生物降解的無毒性材料，其生物相容性好，制備工藝簡單，無有機試劑參與，安全可靠。

3.2 本研究制備的微球粒徑為(334.3±10.54)μm，大小均一，分布較窄，圓整度良好，干燥后的微球表面不光滑，具有一定的紋理，主要是微球縮水形成的，微球吸水后膨脹，紋理會漸漸舒展開， 形成表面光滑的球體。

3.3 制備的微球體外釋藥考察結果表明，30 min時，微球中藥物釋放量均小于20%，避免了藥物的突釋現象。通過零級(R=0.919 5)、一級(R=0.964 8)、Higuchi(R=0.981 3)方程擬合可見，皂苷的釋放符合Higuchi方程，微球具有緩釋作用。分析原因，海藻酸鈉與殼聚糖在水中形成黏稠狀物質，包裹在微球的表面，阻礙藥物溶出，同時水性凝膠本身也會阻礙藥物的溶出，達到長效給藥的目的。藥物在釋放過程中，首先是微球吸收釋放介質膨脹，釋放介質滲入微球內部，將內部的藥物溶解到介質里，主要依靠藥物的擴散作用。另外，溶液的穿透力導致微球的外殼逐步降解或崩解，使內部藥物溶出。所以，釋放過程由擴散過程與降解過程共同控制。

本實驗研究的微球制備方法簡便可行，微球屬于緩釋制劑，因此海藻酸鈉-殼聚糖微球作為藥物的緩釋載體，具有一定的應用前景。

[1]鄒東娜,張典瑞,張學順,等.苦參堿白蛋白微球的制備及性質[J].中國醫藥工業雜志,2006(12):824-827.

[2]劉琳娜,李欣,梅其炳,等.尼莫地平明膠微球的制備及其性質研究[J].華西藥學雜志,2006(3):243-245.

[3]汪自然,徐啟勇,葉燕青.復乳法制備聚乳酸及其共聚物微球參數的研究進展[J].國際生物醫學工程雜志,2006(4):238-242.

[4]李巖,孫殿甲,畢殿洲.聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物微球的制備及體外釋放影響因素研究進展[J].中國現代應用藥學,2002(4):281-284.

[5]盛江峰,馬淳安,張誠,等.噴霧干燥法制備偏鎢酸銨微球時的形貌與粒度[J].高校化學工程學報,2008(1):122-127.

[6]金巖,楊君.葫蘆素脂質體的制備及包封率測定[J].山西醫藥雜志,2008(8):721-722.