抗骨增生片對兔膝骨關節炎軟骨組織病理形態及 MMP-1、TIMP-1的影響*

河北省秦皇島市第二醫院 尹學永 王志文 趙 鑫 （秦皇島 066600）

抗骨增生片具有補腎強骨、活血通絡、消腫止痛之效,臨床應用治療骨關節炎取得滿意療效。該研究通過建立兔膝骨關節炎模型,觀察抗骨增生片對關節軟骨組織病理形態及MMP-1、TIMP-1表達的影響,以進一步探討其作用機理。

1 材料與方法

1.1 藥物 抗骨增生片: 〔熟地黃、鹿銜草、骨碎補（燙）、淫羊藿、肉蓯蓉、雞血藤、萊菔子 （炒）〕,通化華夏藥業有限責任公司生產,批準文號:國藥準字Z22023683。

1.2 實驗動物 健康雄性日本大耳白兔 30只,體重 2.5 kg±150 g。于室溫分籠飼養,按頓供給標準飼料,自由活動、飲水。

1.3 儀器及試劑 木瓜蛋白酶購自天津市諾奧科技發展有限公司,活力 200萬U/g;MMP-1免疫組化試劑盒由上海麥莎生物科技有限公司提供;TIMP-1免疫組化試劑盒由武漢博士德生物科技有限公司提供;石蠟組織切片機,天津天利航空機電有限公司;光學顯微鏡,BX 50型,日本OLYMPUS公司生產。

1.4 方法

1.4.1 動物分組:健康雄性日本大耳白兔 30只,適應性喂養 1周后,將動物按體重由小到大編號,查隨機數字表將大耳白兔分為 3組:A（正常對照組）、B（模型對照組）、C（抗骨增生片給藥組）,每組 10只。

1.4.2 模型建立:參照日本鬼頭康彥[1]等的兔膝關節腔內注入木瓜蛋白酶造成骨關節炎病變模型方法,用氯氨酮注射液肌肉注射 （10mg/kg）將兔麻醉后,于膝關節處剔毛,碘伏消毒,將關節輕彎,經髕腱兩側進針,右膝關節腔內注射 1.6%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液 0.5 mL,隔 3天注射 1次,共注射 3次。

1.4.3 給藥:于造模完成后第 2天開始給藥。C組按成人kg/d體重用藥量的 6倍劑量作為大耳白兔kg/d體重的等效劑量 （抗骨增生片 0.36 g/kg）,溶于 10m L生理鹽水中灌胃,每日1次;A、B組灌入等量生理鹽水;共灌胃 4周。

1.4.4 標本采集及處理:于末次給藥后 24 h氣栓法處死動物,逐層切開膝關節,肉眼觀察關節、滑膜及關節軟骨病理改變,切取脛骨內側髁軟骨,10%中性福爾馬林溶液固定后,石蠟包埋,切片,作HE染色及免疫組織化學觀察。

1.4.5 數據處理:病理組織學評分采用非參數秩和檢驗,免疫組化結果采用方差分析,運用 SPSS13.10統計學軟件進行分析。

2 結果

2.1 大體觀察 A組兔膝關節無腫脹、充血,關節液透明,關節軟骨呈淡藍色、半透明、光滑,滑膜無水腫、肥厚;B組兔右膝關節明顯腫脹、充血,關節液呈淺黃色稍混濁,關節軟骨無光澤、不光滑、不透明,有缺損,可見明顯潰瘍面及裂隙,少數可見軟骨下骨裸露,以脛骨內側髁明顯,滑膜明顯充血、水腫、肥厚;C組兔右膝關節輕度腫脹,無明顯充血,關節液透明稍淺黃,關節軟骨欠光澤、透明度減低,有輕度缺損,未見到明顯潰瘍面和軟骨下骨裸露,滑膜充血、水腫程度較B組明顯減輕。

2.2 光鏡觀察 HE染色切片鏡下觀察,參考彭氏[2]法進行組織病理學分級:按鏡下所見分為 4級:Ⅰ級:軟骨面平整,厚度正常,細胞數及排列正常;Ⅱ級:軟骨面不平整,細胞數減少,細胞排列不規則,可見有新生血管;Ⅲ級:軟骨面可見裂隙及淺表潰瘍病變,細胞排列紊亂,細胞數不多,可見少量炎細胞浸潤;Ⅳ級:軟骨表面可見明顯潰瘍病變,達軟骨深層,細胞數明顯減少,排列紊亂,有明顯炎細胞浸潤,骨質暴露。結果見表1。

2.3 免疫組織化學法觀察 MMP-1、TIMP-1表達 結果判定標準:每張切片隨機取 6個視野 （400倍）,其中 3個位于軟骨表層和中上層,另 3個位于軟骨中下層和下層,計算每個視野的陽性細胞數和細胞總數,MMP-1、TIMP-1的表達量用細胞分數,即陽性細胞數占細胞總數的百分比表示,最大值為 100%,每張切片的細胞計數分別由兩個獨立的觀察者進行,評分誤差率控制在5%以內,取二者均值為最后的得分。結果見表 2。

表1 抗骨增生片對關節軟骨病理形態的影響

表2 抗骨增生片對關節軟骨 MMP-1、TIMP-1表達的影響

3 討論

骨關節炎 （OA）又稱增生性關節炎、退行性關節炎,好發于膝、髖、腰椎等負重大關節。膝骨關節炎 （KOA）是中老年人常見、多發的骨關節病,發病與衰老、創傷、炎癥、肥胖、代謝障礙和免疫、遺傳等因素有關,其確切發病機制尚未明確,但關節軟骨的退行性改變為 OA發病的核心環節已得到共識,蛋白酶異常分泌造成軟骨細胞外基質 （ECM）過量降解在這一過程中起著重要作用。

近年研究提示基質金屬蛋白酶 （MMPs）在OA發病中起主要的作用,[3-4]有研究認為 MMPs對關節軟骨細胞外基質的損傷是 OA發病的 “共同通路”,MMPs的異常增高及與其抑制劑 （TIMP）之間動態平衡的失調,已成為骨關節炎發病機制研究的熱點。MMP-1屬于膠原酶亞族,可切割Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ、Ⅹ型膠原及明膠、可聚蛋白多糖等,在軟骨基質中最具特征、含量最多的Ⅱ型膠原的降解中起著關鍵的作用,[5]由于Ⅱ型膠原結構的破壞及蛋白多糖的過度降解,使軟骨失去正常的彈性及變形能力,關節軟骨功能惡化。正常情況下,MMP-1與其抑制劑 TIMP-1以 1︰ 1的比例特異性結合以維持細胞外基質合成與降解的平衡。研究發現,骨關節炎患者軟骨細胞有高表達的 MMP-1,而TIMP-1增加甚少,呈現 MMPs/TIMPs的失衡,從而導致軟骨降解增加。Marini等[6]證實了關節軟骨的降解是由于MMP和 TIMP之間的失衡造成的,且 MMP/TIMP之比與內窺鏡檢查的疾病進程呈相關性。

骨關節炎屬中醫學 “骨痹”、“痛痹”范疇,其發病與肝腎虧虛、瘀血凝滯密切相關。 《素問?調逆論篇》提出“是人者,素腎氣勝,以水為事;太陽氣衰,腎脂枯不長;一水不能勝兩火,腎者水也,而生于骨,腎不生,則髓不能滿,故寒甚至骨也……病名曰骨痹,是人當攣急也。”清楚的表明了腎氣衰弱是骨痹發生的病機關鍵。唐容川 《血證論》提出 “痹由瘀血致病”說,認為瘀血是痹證發病的重要因素。抗骨增生片適用于肥大性脊椎炎、頸椎病、跟骨刺、增生性關節炎、大骨節病。方中熟地黃、骨碎補、淫羊藿、肉蓯蓉具補腎益精、填髓壯骨之效,雞血藤、鹿銜草、萊菔子具理氣活血、祛風除濕之功,組方切合骨痹腎虛、血瘀之病機,臨床應用能有效緩解膝骨關節炎疼痛、晨僵,消除關節腫脹,恢復關節功能,延緩病情的進展。相關研究[7]表明補腎中藥與活血中藥均能保護軟骨細胞及維持軟骨的完整性,延緩軟骨內膠原的破壞及性質改變,抑制滑膜炎癥及增生,對防止骨關節炎的形成與發展起著非常重要的作用。王氏[8]等報道抗骨增生片能具有明顯的降低全血黏度 （低切速）、血漿黏度、全血還原黏度,并顯著減少血漿中纖維蛋白原含量的作用,具有良好的活血化瘀作用,從而改善局部血液循環,有利于由骨刺引起的水腫消退、炎癥吸收。骨碎補含橙皮甙、骨碎補雙氫黃酮甙、骨碎補酸等,能促進骨對鈣的吸收,并提高血鈣和血磷水平,有利于骨折的愈合,有一定的改善軟骨細胞功能,推遲細胞退行性變的作用;雞血藤、萊菔子、骨碎補還具有一定的抗炎鎮痛作用。[9]

研究結果表明,抗骨增生片有效減輕了膝關節滑膜炎性改變,能降低軟骨病理損害程度,延緩膝骨關節炎軟骨的退行性改變,其抑制軟骨基質降解、促進軟骨修復作用可能與調節關節軟骨 MMP-1及 TIMP-1的異常表達有關。抗骨增生片治療KOA可能是多靶點、多途徑,該藥通過對軟骨基質的作用之外,是否可通過影響軟骨細胞凋亡等途徑而起到治療作用,仍需進一步進行研究。

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（2011-02-22 收稿）