短期應用利尿劑對正常大鼠尿液水通道蛋白 2排泄濃度的影響研究

林 晟,許頂立,賴文巖

水通道蛋白 2(aquaporin-2)是迄今為止發現的最具病理生理意義的水通道蛋白之一,對維持機體水平衡和調節體液容量至為重要,主要分布在腎臟集合管主細胞胞漿內和小管側細胞膜上,在體內主要受血管加壓素 (AVP)調節[1-2];其中部分腎臟 AQP2蛋白可脫落于小管腔經尿液排出[3]。尿液AQP2濃度的檢測可能是一些臨床重要疾病,如心力衰竭水潴留等的重要檢測指標[4]。利尿劑是臨床常用藥物,主要用于調節機體水鈉代謝,利尿劑和 AQP2兩者之間的相互聯系一直是臨床較為關注的問題。本實驗就生理狀況下,短期運用呋塞米、雙氫克尿噻和安體舒通對大鼠尿液中 AQP2的改變進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性 SD(Sprague dawley)大鼠 30只,體質量 180～250g(購自南方醫科大學南方醫院實驗動物中心)。

1.1.2 試劑 呋塞米片,雙氫克尿噻片,安體舒通片。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將 18只 SD大鼠隨機分為呋塞米組、安體舒通組、雙氫克尿噻組,每組 6只。放置代謝籠中,自由進食水 (飼料由南方醫院動物所提供)。環境溫度控制在 25～28℃左右。動物適應 3d后開始灌藥,灌藥 1次/d。將藥物溶于2ml去離子水中,注入胃內。呋塞米組:20mg/kg,雙氫克尿噻組:25mg/kg,安體舒通組:20mg/kg。

1.2.2 尿液的收集 每天收集大鼠尿液記尿量,在 4℃以3000r/min離心 10min,去除細胞殘骸和食物殘渣,加入蛋白酶抑制劑 PMSF,放入-70℃低溫冰箱,尿滲量由南方醫院腎內科實驗室采用冰點抑制法檢測。

1.2.3 ELISA 測定尿液 AQP2濃度[5]尿液用 0.05%SDSPBS等倍稀釋后,取 50m l加入 96孔酶標板,37℃預包被30min,然后 4℃過夜。每 1個孔用洗滌緩沖液 (PBS含0.05%Tween)清洗 1次,然后加入封閉液 (PBS含 3%牛血清白蛋白)100μl 37℃,45min。去除封閉液,加入一抗 (兔抗鼠 1∶1000,用 3%BSA-PBS稀釋)37℃,溫育 2h。然后用洗滌緩沖液清洗 4次,1min/次。稍晾干后加入二抗 (1∶2000),37℃,溫育 90min,用洗滌緩沖液沖洗 4次,每次1min。晾干后加入底物 0.1%ATM顯色 10min,用 2mol/L H2SO4終止反應。應用酶標儀在 450rm處測定吸光度 (od值)。

1.3 統計學方法 應用 SPSS12.0軟件行 One-Way ANOVA統計分析,計量資料以 (±s)表示,各組間比較采用 SNK法,以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尿量的變化 各實驗組用藥 7d后與用藥前相比尿量均顯著增多 (P＜0.05),但 3者增加的趨勢不同。應用呋塞米后尿量顯著增加至用藥后第 4天達峰值,其后尿量有所減少。雙氫克尿噻組和安體舒通組用藥后呈顯著增加趨勢 (見表1～3)。

2.2 尿滲量的變化 呋塞米組用藥后尿滲量呈顯著減少趨勢(P＜0.05),至用藥后第 4天左右,改變漸趨平穩;而雙氫克尿噻組用藥后第 1天尿滲量減少 10%左右,其后呈逐漸增加趨勢,至用藥后第 6天,有顯著增加意義;安體舒通組的尿滲量變化則未見有明顯變化趨勢 (見表1～3)。

2.3 尿肌酐的變化 呋塞米組用藥后尿肌酐呈顯著降低趨勢(P＜0.01);雙氫克尿噻組用藥后第 1天尿肌酐減少 30%左右,此后呈明顯降低趨勢;安體舒通組用藥后第 1天尿肌酐減少 40%左右,其后改變有輕微波動,但總體呈降低趨勢 (見表1～3)。

2.4 尿液 AQP2的濃度 呋塞米組尿液 AQP2濃度用藥后第 1天增加約 15%左右,至第 3天左右逐漸增加至峰值;雙氫克尿噻組用藥后第 1天增加約 13%左右,其后呈逐漸增加趨勢,至第 7d達峰值;安體舒通組在用藥前 3d其值增加明顯,其后雖有增加,但改變不明顯 (見表1～3)。

2.5 尿液 AQP2的排泄量 (經尿肌酐校正) 3組藥物其排泄率均呈顯著增加趨勢 (P＜0.05),其中呋塞米組增加最為明顯,雙氫克尿噻組次之,安體舒通組最弱 (見表1～3)。

表1 呋塞米組用藥 7d尿量、尿滲量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Tab le 1 The clinical effect in Furosemide group

表1 呋塞米組用藥 7d尿量、尿滲量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Tab le 1 The clinical effect in Furosemide group

用藥前 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d尿量(m l) 4.5±1.0 10.7±1.5 16.4±1.4 19.9±1.4 23.3±3.4 22.7±2.7 22.3±2.5 21.4±2.8尿滲量(mosm/kgH2 O) 2058±291 1625±272 1362±194 1244±252 1124±198 1073±215 1154±221 1018±187尿AQP2濃度(ng/m l) 8.1±1.4 10.7±1.5 11.6±1.7 12.7±2.0 11.4±1.3 11.9±1.3 12.7±1.7 13.2±2.0尿肌酐(mmol/ml) 3060±221 1814±281 1069±430 690±214 490±225 327±121 192±56 182±64尿 AQP2/Cr(pg/μmol) 2.8±1.2 7.6±4.83 13.4±7.7 20.3±9.4 31.3±10.2 42.4±17.2 67.4±22.4 78.6±30.4

表2 雙氫克尿噻組用藥 7d尿量、尿滲量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Table2 The clinical effect in Dihydrocholorothiazide group

表2 雙氫克尿噻組用藥 7d尿量、尿滲量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Table2 The clinical effect in Dihydrocholorothiazide group

用藥前 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d尿量(m l) 4.4±1.6 7.4±2.4 12.4±2.1 13.2±1.8 16.9±3.4 18.3±1.9 19.4±1.5 20.3±3.8尿滲量(mosm/kgH2 O) 2122±186 1812±234 2034±194 2334±338 2366±439 2553±288 2654±358 2776±330尿AQP2濃度(ng/m l) 6.6±1.4 8.3±1.8 9.2±1.4 11.1±0.9 11.4±1.2 11.2±1.3 12.7±1.1 13.2±1.4尿肌酐(mmol/ml) 3164±741 2265±524 1913±524 986±231 701±312 503±219 460±170 328±142尿 AQP2/Cr(pg/μmol) 2.4±1.2 4.0±1.1 5.7±2.5 13.6±3.6 24.4±12.6 28.2±15.1 28.6±14.4 47.1±26.8

表3 安體舒通組用藥 7d尿量、尿滲量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Table3 The c linical effect in Antisterone group

表3 安體舒通組用藥 7d尿量、尿滲量、尿肌酐及 AQP2排泄 (±s)Table3 The c linical effect in Antisterone group

用藥前 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d尿量(m l) 4.7±1.0 7.4±1.5 10.3±1.6 12.0±2.4 13.2±2.6 14.4±2.4 16.3±2.8 17.1±2.6尿滲量(mosm/kgH2 O) 2260±382 2145±3377 2020±207 1850±234 1973±314 1975±346 1978±194 2192±350尿AQP2濃度(ng/m l) 7.8±2.1 8.6±1.4 10.2±1.2 11.4±1.0 12.0±1.8 10.2±1.0 11.1±1.1 11.4±2.2尿肌酐(mmol/ml) 3416±887 2850±614 1593±430 1093±654 932±339 771±417 470±246 449±312尿 AQP2/Cr(pg/μmol) 2.4±1.2 4.3±2.5 6.8±2.3 15.4±1.8 15.7±8.4 18.8±11.0 31.5±18.4 36.3±18.1

3 討論

AQP2是 1988年克隆發現的水通道家族中的一員,主要分布在腎臟集合管主細胞的胞漿內和管腔側細胞膜上,在機體內主要受 AVP調節以出胞的方式和管腔膜融合,從而水通道開放,水重吸收增加。在尿液的沖刷作用下部分 AQP2可脫落排出,正常的水供應條件下每天大約有 3%～4%的腎內總 AQP2經尿液排出,尿液中檢測到的 AQP2含量與主細胞管腔膜上AQP2呈正相關,同時也與血液中 AVP的作用和腎臟 AQP2水平相關。我們發現在心力衰竭的大鼠和患者都存在有尿液中AQP2的排泄增加,尿液中的 AQP2可作為臨床監測心力衰竭時水鈉潴留的重要指標[6-7]。

利尿劑是目前臨床運用較多的調節機體水電解質平衡的重要藥物,尤其在充血性心力衰竭的治療中有著較為廣泛的運用。各種利尿劑的作用機制各不相同,對 AQP2的影響也不一致,我們通過 ELISA方法檢測尿液中的 AQP2排泄來初步評價各種利尿劑對其影響,從而更好地指導臨床上對于心力衰竭病人治療過程中的 AQP2的監測。但由于尿液 AQP2濃度受到尿量的影響,故將每份尿液 AQP2濃度與尿肌酐相比,用尿液AQP2/肌酐來評價尿液 AQP2的排泄率。Uenishi F等[8]提出,尿液 AQP2/肌酐與尿滲量呈正相關。

在我們的實驗中發現,3種利尿藥物作用均可引起尿量和尿液 AQP2排出的明顯增加,這與一些相關報道結果一致[9],但增加的趨勢各不相同,且尿滲量的改變也不相同。呋塞米在藥物干預第 1天即引起尿量的顯著增加,至干預后第 4天達到尿量峰值,其后尿量增加減少,但仍維持在一個較高水平,其尿滲量的改變亦表現為干預前 4天顯著下降而其后漸趨平穩。其尿液 AQP2的排泄率在早期隨著尿液增加排出增加,即使尿量有所減少,其排泄率仍呈增加趨勢;而雙氫克尿噻和安體舒通雖然引起尿量增加沒有呋塞米明顯,但總體呈增加趨勢,且伴隨著尿量的增加,AQP2的排泄率也顯著增加。這與雙氫克尿噻引起尿滲量增加相一致,而安體舒通組尿滲量改變不明顯,可能與其利尿作用較弱且具有保鉀功能有關。

呋塞米組 AQP2排泄率隨著尿量增加而增加的同時,在尿量開始有所減少的藥物干預后第 4天仍有所增加,所以我們認為在呋塞米引起的 AQP2排出增加的原因中,除了尿量增加這一影響因素外,管腔膜上的 AQP2的增加更是其尿量減少后排出率繼續增加的主要原因,這可能正是臨床上使用呋塞米后期出現利尿效果減弱的機制之一。

1 Nislesen S,Agre P.The aquaporin family of water channels in kidney[J].Kidney Int,1995,48(40):1057-1068.

2 許頂立,任昊,Martin PY,等.充血性心力衰竭大鼠腎臟Aquaporin-2水通道蛋白基因的表達 [J].中華醫學雜志,1998,78(2):118-120.

3 Umenishi F,Summer SN,Cadnapaphornchai M,et al.Comparison of three methods to quantify urinary aquaporin-2 protein[J].Kidney Int,2002,62(6):2288-2293.

4 許頂立,任昊.慢性心力衰竭水潴留機制的研究進展 [J].第一軍醫大學學報,2001,21(1):65-67.

5 江榮炎,許頂立,賴文巖,等.間接酶聯免疫吸附法定量檢測大鼠尿液水通道蛋白-2濃度 [J].中華老年心血管病雜志,2005,4:261-263.

6 許頂立,任昊,鄧英姿,等.腎臟 Aquaporin 2水通道蛋白的檢測及其在充血性心力衰竭的應用 [J].腎臟病與透析腎移植雜志,1998,7:196-198.

7 Xu DL,Martin PY,Ohara M,et al.Upregulation of aquaporin-2 water channel expression in chronic heart failure rat[J].JClin Invest,1997,99(7):1500-1505.

8 Starklint J,Bech JN,Nvvad O,etal.Increased urinary aquaporin-2 excretion in response to furosem ide in patients with chronic heart failure[J].Scand JClin Lab Invest,2006,66(1):55-66.

9 Starklint J,Bech JN,Nvvad O,et al.Urinary excretion of aquaporin-2 after furosemide and felodipine in healthy humans[J].Scand J Clin Lab Invest,2005,65(3):249-261.