色象中藥對人 A375黑素瘤細胞增殖及黑素合成的影響*

洪遜強 楊 柳 劉利利 潘恩山 南方醫科大學中西結合醫院皮膚科(廣州 510315)

色素障礙性皮膚病易診難治,目前臨床上尚缺乏較有效的治療方案,對其機理仍不十分清楚。中醫在長期醫療實踐中積累了“以白治黑,以黑治白”的臨床經驗。2007年以來,我們對中藥色象理論形成的背景及研究意義多次在全國中西醫結合、中醫及中西醫結合皮膚病專業學術會議進行交流[1～3],首次將這種表明藥材顏色與療效相關的現象,稱之為“中藥色象”。將這種治療色素病色效相關的中藥,稱之為“色象中藥”。本研究通過查閱大量的文獻資料及臨床資料,篩選出中醫傳統治驗及現代研究表明治療色素病有效的黑白兩類中藥各 10種,研究色象中藥對黑素細胞增殖及黑素合成的影響,探討色象中藥與色素代謝的相關性,為色象理論及臨床辨證用藥提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 黑素瘤細胞株來源 人 A375黑素瘤細胞株由中國科學院上海細胞研究所提供。

1.2 實驗中藥 包括制首烏、熟地、女貞子、菟絲子、補骨脂、紅花、丹參、雞血藤、墨旱蓮、益母草、白茯苓、白術、白蒺藜、白及、白芷、桃仁、當歸、山藥、白芍、薏苡仁,購自南方醫科大學南方醫院中藥房,經南方醫科大學中醫系中藥炮制教研室鑒定。

1.3 試劑 M T T(四甲基偶氮唑藍)、二甲基亞砜(DMSO)、0.25%胰蛋白酶-EDT A(美國 Sigma公司),DMEM培養液(高糖)、10%胎牛血清(美國 Gibco公司),其它試劑均為國產分析純。

1.4 主要儀器 倒置顯微鏡(Nikon公司),自動酶標儀(芬蘭 Thermo公司 )等。

2 方 法

2.1 實驗藥物分組 依據飲片的外在顏色分為黑白兩組,每組各選 10味藥作為代表藥 ,①黑 (深 )色組 (制首烏、熟地、女貞子、菟絲子、補骨脂、紅花、丹參、雞血藤、墨旱蓮、益母草 );②白(淺)色組(白茯苓、白術、白蒺藜、白及、白芷、桃仁、當歸、山藥、白芍、薏苡仁)。

2.2 中藥藥液的制備 分別稱取上述 20味中藥,單味藥物飲片經鑒定后置砂鍋中,加相當于藥材量的 8倍的蒸餾水浸泡 2h,煮沸 30min過濾。藥渣加 5倍水繼續煎煮,煮沸 30min過濾。合并兩次濾液,于水浴上分別進行濃縮 ,用不含胎牛血清培養基進行稀釋,使藥物終質量濃度為 20μg/mL、10μg/mL、5μ g/mL,儲存備用。

2.3 黑素瘤細胞增殖的測定[4]采用四甲基偶氮唑藍比色法(M TT法),細胞常規培養后,取對數生長期細胞常規消化 ,調整細胞為 5× 104個 /mL,取 100 μl接種于 96孔板,37℃及 5% CO2下孵育 24h后,每孔加入 100μl不含胎牛血清培養基稀釋好的中藥,使藥物終質量濃度為 20 μg/mL、10 μg/mL、5μ g/mL,每個濃度設 3個復孔,并設對照組:單純培養基組、中藥對照組(培養基+中藥 )和空白對照組(培養基+細胞),置于孵箱中作用 48h后,棄上清液,用不含 Ca2+和 Mg2+的 PBS液洗 2遍,每孔加入 5g/L的 M T T溶液 20μl,于 37℃及 5%CO2下孵育下 4h,棄上清液,每孔加 150μl DM SO,振蕩 10min,在酶標儀 490nm波長下測量各孔吸光度值(OD值),每組重復 3次,取平均值。用吸光度值表示細胞增殖。細胞增殖=實驗組的吸光度值 中藥對照組的吸光度值;空白對照組細胞增殖=空白對照組的吸光度值 單純培養基對照組的吸光度值。

2.4 黑素合成含量測定[5,6]NaOH裂解法,黑素細胞接種方法同上,設立對照組同前。藥物作用 48h后,棄上清液,用不含 Ca2+和 Mg2+的 PBS液洗 2遍,然后加入 100μL1N NaOH(含 10%DM SO)在 37℃水浴保溫 2h,用酶標儀測定490nm波長的吸光度值,每組重復 3次,取平均值。用吸光度值表示黑素含量,黑素含量=實驗組的吸光度值 中藥對照組的吸光度值;空白對照組黑素含量=空白對照組的吸光度值 單純培養基對照組的吸光度值。

2.5 統計學方法 利用 SPSS13.0統計軟件,采用單因素方差分析進行統計處理。

3 結 果

3.1 實驗中藥對黑素瘤細胞增殖的影響 如表 1、表 2。結果表明:黑色組藥物中除益母草外,其余 9種對黑素細胞增殖均有促進作用,與空白對照組相比,差異均有顯著性(P＜0.05或 P＜0.01);白色組藥物中除桃仁、薏苡仁、山藥外,其余 7種對黑素細胞增殖均有明顯抑制作用,差異均有顯著性(P＜0.05或 P＜0.01)。另外 ,研究發現白蒺藜、白芷、白茯苓、白芍、熟地這五味藥物具有雙向調節作用,而桃仁雖為白色,但卻起著促進作用。益母草、薏苡仁、山藥與空白對照組相比,差異均無顯著性(P＞ 0.05)。

表1 黑色組中藥對細胞增殖的影響(±s)

表1 黑色組中藥對細胞增殖的影響(±s)

與空白對照組比較:△P＜0.05,▲P ＜0.01

不同濃度藥物作用48h后OD值中 藥5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白對照組OD值制首烏 0.5327±0.0448 0.5826±0.0189▲ 0.6366± 0.0146▲ 0.4961±0.0174熟 地 0.4432±0.02581△ 0.5476±0.0283 0.5754± 0.0368△ 0.4961±0.0174女貞子 0.5004± 0.0192 0.5273± 0.0150 0.5337± 0.0246△ 0.4961± 0.0174補骨脂 0.5696±0.0318△ 0.5881±0.0577△ 0.6112± 0.0175▲ 0.4961±0.0174紅 花 0.5153±0.0274 0.5481±0.0263△ 0.5748± 0.0251▲ 0.4961±0.0174菟絲子 0.5733±0.0302△ 0.5772±0.0335△ 0.6071± 0.0229▲ 0.4961±0.0174丹 參 0.5703±0.0385△ 0.5989±0.0315▲ 0.6354±0.0185▲ 0.4961±0.0174雞血藤 0.5726±0.0269▲ 0.5856±0.0260▲ 0.6336± 0.0303▲ 0.4961±0.0174墨旱蓮 0.5582± 0.0322△ 0.5271± 0.0265 0.5085± 0.0282 0.4961± 0.0174益母草 0.5080± 0.0237 0.5192± 0.0383 0.5257± 0.0263 0.4961± 0.0174

表2 白色組中藥對細胞增殖的影響(±s)

表2 白色組中藥對細胞增殖的影響(±s)

與空白對照組比較:△P＜0.05,▲P ＜0.01

不同濃度藥物作用48h后OD值中 藥5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白對照組OD值山 藥 0.4902± 0.0174 0.4810± 0.0253 0.4663± 0.0235 0.4961± 0.0174白 術 0.4727±0.0295 0.4525±0.0178△ 0.4482± 0.0169△ 0.4961±0.0174白蒺藜 0.4277±0.0203▲ 0.4516±0.0086△ 0.5404± 0.0375△ 0.4961±0.0174白 及 0.4633±0.0233 0.4503±0.0193△ 0.4433± 0.0178△ 0.4961±0.0174桃 仁 0.4972± 0.0215 0.5235±0.0234 0.5425± 0.0175△ 0.4961± 0.0174白 芷 0.4272±0.0191▲ 0.4487±0.0152△ 0.5348±0.0238△ 0.4961±0.0174當 歸 0.4734±0.0094 0.4606±0.0135△ 0.4529± 0.0200▲ 0.4961±0.0174白茯苓 0.5448±0.0223△ 0.4912±0.0152 0.4156± 0.0248▲ 0.4961±0.0174白 芍 0.5335±0.0177△ 0.4950±0.0134 0.4616± 0.0140△ 0.4961±0.0174薏苡仁 0.4968± 0.0306 0.4717± 0.0174 0.4848± 0.0254 0.4961± 0.0174

3.2 實驗中藥對黑素含量的影響 如表 3、表 4。結果表明:黑色組藥物中除益母草外,其余 9種對黑素細胞合成均有促進作用,與空白對照組相比較,差異均有顯著性(P＜0.05或P＜0.01);白色組藥物中除桃仁、薏苡仁外,其余 8種對黑素細胞增殖均有明顯抑制作用,與空白對照組比較,差異均有顯著性(P＜0.05或 P＜0.01)。另外,白蒺藜、白芷、白茯苓、白芍、熟地這五味藥物具有雙向調節作用,而桃仁雖為白色,但卻起著促進作用。益母草、薏苡仁與空白對照組相比,差異均無顯著性(P＞ 0.05)。

表3 黑色組中藥對黑素含量的影響(±s)

表3 黑色組中藥對黑素含量的影響(±s)

與空白對照組比較:△P＜0.05,▲P ＜0.01

不同濃度藥物作用48h后OD值中 藥5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白對照組OD值制首烏 0.4500± 0.0279 0.4644± 0.0267 0.4897± 0.0108△ 0.4265± 0.0359熟 地 0.3721±0.0265△ 0.4528±0.0234 0.4982± 0.0254△ 0.4265±0.0359女貞子 0.4349± 0.0276 0.4614± 0.0363 0.4908± 0.0183△ 0.4265± 0.0359補骨脂 0.4462±0.0216 0.4746±0.0242△ 0.5048± 0.0152▲ 0.4265±0.0359紅 花 0.4374±0.0291 0.4828±0.0297△ 0.5014± 0.0182△ 0.4265±0.0359菟絲子 0.4842±0.0163△ 0.5016±0.0288▲ 0.5252± 0.0245▲ 0.4265±0.0359丹 參 0.5132±0.0208▲ 0.5339±0.0242▲ 0.5688±0.0303▲ 0.4265±0.0359雞血藤 0.5216±0.0289▲ 0.5688±0.0369▲ 0.6271± 0.0360▲ 0.4265±0.0359墨旱蓮 0.5022± 0.0337△ 0.4406± 0.0342 0.4515± 0.0399 0.4265± 0.0359益母草 0.4415± 0.0387 0.4475± 0.0226 0.4682± 0.0162 0.4265± 0.0359

表4 白色組中藥對黑素含量的影響(±s)

表4 白色組中藥對黑素含量的影響(±s)

與空白對照組比較:△P＜0.05,▲P ＜0.01

中 藥不同濃度藥物作用48h后OD值5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白對照組OD值山 藥 0.4156± 0.0152 0.3921±0.0084 0.3736± 0.0254△ 0.4265± 0.0359白 術 0.4189±0.0119 0.3728±0.0268△ 0.3580± 0.0259△ 0.4265±0.0359白蒺藜 0.3178±0.0183▲ 0.3662±0.0183△ 0.4854± 0.0366△ 0.4265±0.0359白 及 0.4034±0.0108 0.3653±0.0273△ 0.3378± 0.0180▲ 0.4265±0.0359桃 仁 0.4409±0.0210 0.4840±0.0220△ 0.5000± 0.0338△ 0.4265±0.0359白 芷 0.3063±0.0165▲ 0.3824±0.0120 0.4845± 0.0342△ 0.4265±0.0359當 歸 0.4059± 0.0200 0.3877±0.0207 0.3510± 0.0267△ 0.4265± 0.0359白茯苓 0.4891±0.0348△ 0.3789±0.0242 0.2972± 0.0179▲ 0.4265±0.0359白 芍 0.4890±0.0390△ 0.3674±0.0223△ 0.3525±0.0189△ 0.4265±0.0359薏苡仁 0.4186± 0.0139 0.4145± 0.0160 0.4150± 0.0221 0.4265± 0.0359

4 討 論 中醫在長期的臨床實踐中積累了應用白色藥物 (如白芷、白附子、白茯苓等)治療色素沉著類皮膚病 ,應用黑色藥物 (如首烏、熟地、黑芝麻等)治療色素減退類皮膚病的治療經驗。近年來,國內已經有更多的同行注意到了藥材本身顏色與藥效的關系,如湖南中醫藥大學歐陽恒教授[7]總結此類以白治黑,以黑治白之法為“以色治色法”,研創紫銅消白方(主要由紫銅、丹參、紫草、紅花等多味紫紅色藥材組成)治療白癜風取得較好臨床療效而獲 1994年度國家中醫藥管理局科技進步獎。楊志波[8]對“以色治色法”治療色素障礙性皮膚病進行初步研究,認為顏色深的藥物可能含有較多的增色物質,這些物質能促進黑素細胞的增殖以及酪氨酸酶的活性,從而促進黑色素的合成;顏色淡的藥物中可能含有較多的褪色物質,這些物質能抑制黑素胞的增殖以及酪氨酸酶的活性。另外,許愛娥[9]等將對酪氨酸酶激活率較高的墨旱蓮、無花果、沙苑子 3種中藥加入活性碳脫色處理后,發現 3種中藥均不能再激活酪氨酸酶,提示中藥的色素與酪氨酸酶的活性具有一定的相關性。

本研究從新的角度出發,運用新的理論假說,探討中藥對細胞增殖及黑素合成的影響,結果發現黑色或深色類藥物促進細胞增殖及黑素合成的作用更明顯,而白色或淺色類藥物的抑制作用更明顯。說明藥材顏色與色素代謝調節存在一定的相關性,為臨床應用中藥治療色素代謝障礙性疾病用藥提供了較科學的實驗依據。同時,研究還發現并非所有藥物都具有這一特性,部分藥物具有雙向調節作用,少數藥物具有相反調節作用或者無調節作用,而白蒺藜的雙向調節作用與我們以往的研究結果[10-11]一致。另外,有些藥物的作用與以往報道略有不同或相反,這可能與藥物產地、炮制加工方法、藥物濃度以及實驗條件不同等諸多因素有關。綜合我們的實驗結果,提示臨床上應用色象理論指導治療色素沉著性皮膚病(黃褐斑)或色素脫失性皮膚病(白癜風)是可行的,針對不同的疾病其用藥應有所不同,前者宜多用淺色類藥物治療,后者宜多用深色類藥物治療。當然,把藥物進行脫色處理后對細胞增殖及黑素合成有無調節作用?中藥的顏色種類繁多,如何進行合理歸類?不同顏色配伍對實驗結果的影響如何?實驗結果與臨床療效的關系等問題都有待更深入的研究。

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