對氨基酸紙層析實驗的改進

陳舒麗， 王梅娟， 羅麗丹， 劉漢才， 羅德生 (咸寧學院基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室， 咸寧437100;通訊作者，E-mail:jxa12419@126.com)

紙層析是以濾紙作為支持物分離混合物的一種分配層析方法。濾紙纖維和水有較強的親和力，與有機溶劑的親和力很弱。故而在層析時，以濾紙纖維及其結合的水作為固定相，以有機溶劑作為流動相。當流動相沿紙經過樣品時，樣品點上的溶質在水和有機相之間不斷進行分配，隨著流動相的不斷移動，各種不同的部分按其各自的分配系數不斷進行分配，從而使物質得到分離和提純［1］。紙層析法是常用的一種分離混合氨基酸的方法，也是大中專院校生物化學實驗中的一個常規性實驗。在多年的實驗教學中，我們發現有些試劑及實驗步驟需要改進。傳統實驗中，通常用苯酚做展層劑。苯酚是一種有毒物質，對皮膚有較強的腐蝕性，對人體毒性較大，而且價格較貴。傳統實驗中，氨基酸層析完畢后，用茚三酮溶液噴霧顯色，由于噴霧不均，容易造成顯色不均。本研究將茚三酮加入展層劑中，通過比較苯酚與3種濃度不同的乙醇作為展層劑的效果，從而降低實驗試劑對人體的危害，簡化實驗步驟，降低實驗成本，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 0.1 mol/L丙氨酸溶液，0.1 mol/L谷氨酸溶液，0.1 mol/L丙氨酸及谷氨酸混合液，0.01 mol/L(pH 7.4)磷酸鹽緩沖液，0.1% 茚三酮溶液，水飽和苯酚溶液，65%，75%，85%乙醇－茚三酮溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 點樣 取直徑10 cm圓形濾紙一張，用圓規作半徑0.8 cm的同心圓，將圓周平均分成三部分，分別標記1，2，3。用毛細管在濾紙的1處點加丙氨酸和谷氨酸混合液2滴，2和3兩處分別點加丙氨酸和谷氨酸溶液各1滴。

在濾紙圓心處打一小孔(如鉛筆芯大小)，另取一條狀濾紙，長約4 cm，寬約2 cm，下一半剪成須狀，卷成圓筒，如燈芯插入小孔，勿使其突出濾紙面。

1.2.2 層析和顯色 在8個直徑為10 cm的圓形層析缸中分別加入4種不同的展層劑，即水飽和苯酚，65%，75%，85%乙醇溶液(含0.1%茚三酮)，每種溶液均平行做2份。把濾紙平放在展層缸上，使燈芯浸入展層劑中，溶劑沿燈芯上升到濾紙，并向四周擴散，待溶劑前沿擴散至濾紙邊緣約1 cm時，取出濾紙，用鉛筆劃出溶劑前沿，在烤箱中烤干。由于乙醇展層劑中直接加入了茚三酮，故從烤箱中取出的6張濾紙上有紫色的弧形色斑;用水飽和苯酚做展層劑的濾紙拿出后噴0.1%茚三酮溶液，放入烤箱中第二次烤干，出現紫色的弧形色斑。用鉛筆描出色斑輪廓，取兩份平行結果的平均值，以下列公式計算遷移率(Rf):

2 結果

經過展層作用后，谷氨酸與丙氨酸在4種展層劑中的遷移率見表1，層析圖譜見圖1－4。

表1 兩種氨基酸在四種配方中的遷移率

圖1 不同展層劑的層析圖譜

通過計算2種氨基酸的Rf值及8張濾紙的層析圖譜結果可以看到:點樣1處的混合氨基酸均可以分離，離點樣點較遠的斑點為丙氨酸，離點樣點較近的斑點為谷氨酸;水飽和苯酚溶液和75%乙醇分離氨基酸的效果最為明顯，且2種氨基酸在2種展層劑中的遷移率也較接近;65%乙醇分離效果不如上述2種展層劑明顯，但是仍然可以分離;而85%乙醇分離效果較差，2種氨基酸的遷移率均較小。由此可以說明，用75%乙醇制成的展層劑能達到分離混合氨基酸的目的，而且效果較好。

3 討論

3.1 兩種展層劑的比較 原展層劑中苯酚是一種有毒的有機試劑，對皮膚、黏膜有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經或損害肝、腎功能;吸入蒸氣可引起頭痛、頭昏、乏力、視物模糊等癥狀［2］。由于腐蝕性極強，操作時應戴手套及防護鏡等，所有操作均應在通風櫥中進行;這些都給實驗操作帶來不便。而新展層劑中的乙醇則安全無毒，沒有腐蝕性。因此在實驗操作中，無須戴手套，也不用在通風櫥中進行。這些既簡化了實驗的操作過程，又避免了苯酚對實驗人員的毒性;而且與苯酚相比較，乙醇價格便宜，可以節約實驗室開支［3］。

3.2 兩種顯色方法的比較 如果展層劑中沒有加入顯色劑茚三酮，需展層完畢烘干后將茚三酮噴霧在濾紙上。由于是手動操作，容易造成噴霧不均，色斑顯色不均勻，易擴散，使得濾紙表面不干凈，影響Rf值的測定。為了克服這一缺點，本實驗將茚三酮溶解于展層劑中［4］。在層析過程中，茚三酮隨展層劑沿濾紙向四周擴散，由于固定了顯色劑的量，故從烤箱中取出濾紙后能看見藍紫色色斑均勻分布在濾紙上，顯色效果較好，濾紙表面比較干凈，利于Rf值的測定，不僅縮短了實驗時間，而且使操作更簡單，效果更好［5］。

綜上所述，用75%乙醇配制的展層劑，可以代替原有的水飽和苯酚，能夠較好地分離氨基酸;另外將茚三酮加入展層劑中，可以更好地顯色。以上改進，不僅簡化了實驗步驟，縮短了實驗時間，優化了實驗結果，并且對人體沒有任何毒性和腐蝕性，達到了預期的效果。

［1］ 羅德生，劉紅梅，李映紅，等.生物化學與分子生物學實驗教程［M］.北京:科學出版社，2007:83－85.

［2］ 楊若明.環境中有毒有害化學物質的污染與監測［M］.北京:中央民族大學出版社，2001:152－154.

［3］ 王筑婷，吳青青.圓形紙層析法鑒定轉氨基作用的實驗改進［J］.貴陽醫學院學報，2008，33(4):418 －419.

［4］ 榻金彩，周桂.對“植物體內的轉氨基作用”實驗的改進［J］.生物學通報，2006，41(1):50 －51.

［5］ 田明，高錚，蘇英華，等.氨基酸紙層析實驗的進一步探討［J］.實驗室科學，2009，28(6):64 －65.