蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)根瘤菌對(duì)鉛鋅響應(yīng)研究

摘要：以從蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)已分離純化的１０株豆科植物根瘤菌為研究對(duì)象，用含50～１ ５００ ｍｇ／Ｌ的鉛、200～２ ０００ ｍｇ／Ｌ的鋅的單鹽ＹＭＡ培養(yǎng)基和雙鹽培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察根瘤菌的生長(zhǎng)情況，篩選出３株耐（抗）鉛鋅菌株，分別為菌株１４．２．９、１８．２．１７、３．２．３。結(jié)合生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)耐性強(qiáng)的菌株對(duì)各種糖利用特征與其他菌有所不同，能產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣；分解利用油脂、淀粉、明膠等物質(zhì)的能力高于耐性弱的根瘤菌。說(shuō)明在蘭坪尾礦區(qū)根瘤菌存在多種生理類型，很可能通過(guò)改變代謝途徑適應(yīng)重金屬污染的環(huán)境。

關(guān)鍵詞：蘭坪尾礦區(qū)；鉛鋅；根瘤菌；耐性；響應(yīng)

中圖分類號(hào)：Ｑ９４５．７８文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）13－2639-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｌｅａｄ ａｎｄ Ｚｉｎｃ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｂｉａ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｌａｎｐｉｎｇ

Ｌｅａｄ-Ｚｉｎｃ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔａｉｌｉｎｇｓ

ＺＨＡＮＧ Ｗｕ－ｘｉａｎａ，ＷＡＮＧ Ｊｉｎ－ｈｕａｂ，ＸＩＯＮＧ Ｚｈｉｂ，ＨＡＯ Ｍｉｎｇｂ，ＸＩＥ Ｑｉ－ｔａｎｇｂ

（ａ． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ； ｂ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The ceｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ １０ ｒｈｉｚｏｂｉａ ｏｆ ｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓ ｐｌａｎｔｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｌａｎｐｉｎｇ ｌｅａｄ－ｚｉｎｃ （Ｐｂ－Ｚｎ） ｍｉｎｉｎｇ ｔａｉｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｏｎ ＹＭＡ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ adding ５０～１ ５００ ｍｇ／Ｌ Ｐｂ２＋， ２００～２ ０００ ｍｇ／Ｌ Ｚｎ２＋ or disalt． Three strains，３．２．３， １４．２．９ ａｎｄ １８．２．１７ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ ａｓ Ｐｂ－Ｚｎ ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａnｃｅ ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ １４．２．９，１８．２．１７，３．２．３ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐｂ－Ｚｎ ｌｏｗ ｒｅｓｉｓｔａｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ， ｔｈｅｓｅ ３ ｒｈｉｚｏｂｉａ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｏｕｒ instead of gas， ａｎｄ ｔｈｅｙ ｈａｄ ｈｉｇｈ ａｂｉｌｉｔｙ of hydrolyzing ｌｉｐｉｎ， ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｇｅｌａｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｒｈｉｚｏｂｉａ ｉｎ Ｌａｎｐｉｎｇ Ｐｂ－Ｚｎ ｍｉｎｉｎｇ ｔａｉｌｉｎｇｓ ｈａｄ ａｂｕｎｄａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｉｚｏｂｉａ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｂ－Ｚｎ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ was ｐｒｏｂａｂｌｙ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌａｎｐｉｎｇ ｍｉｎｉｎｇ ｔａｉｌｉｎｇｓ； ｌｅａｄ－ｚｉｎｃ； ｒｈｉｚｏｂｉａ； ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； ｒｅｓｐｏｎｓｅ

蘭坪白族普米族自治縣隸屬云南省怒江傈僳族自治州，礦藏資源極其豐富，享有“云南有色金屬之鄉(xiāng)”的盛譽(yù)。金頂鳳凰山特大鉛（Ｐｂ）鋅（Ｚｎ）礦，儲(chǔ)量達(dá)１ ４２９萬(wàn)金屬噸，位居全國(guó)之首、世界第二［１］。蘭坪鉛鋅礦山經(jīng)過(guò)數(shù)十年大規(guī)模地開采，尾礦區(qū)的生態(tài)受到嚴(yán)重破壞，重金屬污染嚴(yán)重。尾礦區(qū)植被恢復(fù)的最重要限制因子之一是養(yǎng)分的不足，而氮素的極端不足又是養(yǎng)分不足的核心問(wèn)題［２］。在蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)自然生長(zhǎng)有多種豆科植物，大多豆科植物都能與根瘤菌構(gòu)成共生體系而固氮，增加土壤肥力，增強(qiáng)植物抗逆性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，這一體系的構(gòu)建將有助于尾礦區(qū)植被的恢復(fù)［３，４］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)豆科植物根瘤菌的影響僅見(jiàn)于繆福俊等［５］的研究。本研究針對(duì)該尾礦區(qū)豆科植物根瘤菌的鉛鋅響應(yīng)進(jìn)行分析，希望找到鉛鋅抗性強(qiáng)的根瘤菌，以期為采用合適的“根瘤菌-豆科植物”共生體系改良蘭坪鉛鋅尾礦土壤及植被恢復(fù)提供依據(jù)。

１材料與方法

１．１供試菌株及培養(yǎng)基

西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院特殊環(huán)境固氮菌課題組保存的１０株分離篩選自蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)自然生長(zhǎng)的9種豆科植物根瘤菌純種（表１），活化后待用。細(xì)菌固體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（ＹＭＡ培養(yǎng)基），調(diào)ｐＨ值至７．０～７．２，１２１ ℃滅菌２０ ｍｉｎ。

１．２生理生化指標(biāo)測(cè)定

按沈萍等［６］的方法，分別測(cè)定１０株根瘤菌生理生化指標(biāo)（油脂水解、淀粉水解、Ｖ．Ｐ．試驗(yàn)、Ｍ．Ｒ．試驗(yàn)、明膠液化、吲哚試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)）。

１．３土壤鉛鋅含量的測(cè)定

土壤鉛、鋅含量使用ＡＡＮＡ／ＹＳＴ １００型原子吸收光譜儀進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定土壤鋅參照ＧＢ／Ｔ １７１３８－１９９７，土壤鉛參照ＧＢ／Ｔ １７１４１－１９９７。

１．４鉛鋅響應(yīng)試驗(yàn)

以蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)的土壤重金屬含量測(cè)定結(jié)果為依據(jù)，將ＹＭＡ培養(yǎng)基滅菌冷卻至５０ ℃，按劑量添加１００ ｍｇ／Ｌ（以Ｚｎ２＋、Ｐｂ２＋計(jì)量）的ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ和Ｐｂ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）·３Ｈ２Ｏ溶液，制成含不同濃度梯度的鉛、鋅單鹽及鉛鋅雙鹽重金屬選擇性ＹＭＡ培養(yǎng)基。

單因素試驗(yàn)：將供試菌株接種在含有不同濃度單鹽的ＹＭＡ培養(yǎng)基上，鉛鹽濃度依次是５０、２００、４００、６００、１ ０００、１ ５００ ｍｇ／Ｌ（分別用１～６表示）；鋅鹽濃度依次是２００、４００、８００、１ ２００、１ ６００、２ ０００ ｍｇ／Ｌ（分別用１～６表示）；以無(wú)重金屬的ＹＭＡ平板為對(duì)照，接種，２８ ℃培養(yǎng)觀察２～１０ ｄ，生長(zhǎng)記為“＋”，不生長(zhǎng)記為“－”［７］。

雙因素試驗(yàn)：將供試菌株接種在不同濃度的鉛鋅雙鹽ＹＭＡ培養(yǎng)基上，鉛、鋅重金屬濃度梯度設(shè)置如表２所示，以無(wú)重金屬的ＹＭＡ平板作對(duì)照，接種，２８ ℃培養(yǎng)觀察２～１０ ｄ，記錄同上。

２結(jié)果與分析

２．１生理生化指標(biāo)特性

由表３可知，供試的１０株根瘤菌存在多種的代謝類型，來(lái)自同一株植物（美麗胡枝子）分離的根瘤菌代謝類型也不同。菌株１４．２．９、１８．２．１７、３．２．３分解利用油脂、淀粉、明膠的能力均較強(qiáng)；均能發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；菌株１８．２．１７、３．２．３能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

２．２尾礦區(qū)土壤鉛鋅含量

通過(guò)蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)土壤重金屬含量與其他土壤重金屬含量均值的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)蘭坪地區(qū)的總Ｐｂ的含量分別是全國(guó)及云南省土壤（Ａ層）背景均值的１３８．６０倍和８８．７６倍；有效Ｚｎ的含量遠(yuǎn)高于華南5個(gè)鉛鋅尾礦區(qū)均值［８］，是全國(guó)及云南省土壤（Ａ層）背景均值的７０．０８倍和５７．９７倍。說(shuō)明蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)Ｐｂ、Ｚｎ含量較高，重金屬污染嚴(yán)重（表４）。

２．３鉛鋅對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)的影響

從鉛鋅對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)的影響情況（表５）可以看出，多數(shù)根瘤菌在低濃度鋅（＜８００ ｍｇ／Ｌ）脅迫下可以生長(zhǎng)，有良好的耐鋅能力，但根瘤菌對(duì)鉛的耐受力較低，在６００ ｍｇ／Ｌ的鉛脅迫下只有１株根瘤菌能夠生長(zhǎng)，這可能與蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)高鋅低鉛的土壤特性有關(guān)。

另有研究［９］表明，低濃度的重金屬能刺激微生物的生長(zhǎng)，但超過(guò)一定濃度時(shí)對(duì)微生物則有毒害效應(yīng)。從表５可以看出，根瘤菌在鉛鋅雙鹽脅迫下的生長(zhǎng)情況與單鹽不同。在含低濃度鋅的雙鹽脅迫下，５０％的根瘤菌生長(zhǎng)良好，證明低濃度鋅可以緩解鉛對(duì)微生物的毒害作用。菌株３．２．３、１８．２．１７、１４．２．９對(duì)鉛鋅雙鹽脅迫有較強(qiáng)的耐（抗）能力，菌株３．２．３為鉛鋅高耐（抗）性菌株。

結(jié)合生理生化指標(biāo)分析，結(jié)果顯示耐性強(qiáng)的菌株對(duì)各種糖利用特征與其他菌有所不同，能產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣；其分解利用油脂、淀粉、明膠等物質(zhì)的能力高于耐性弱的根瘤菌。說(shuō)明在蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)根瘤菌存在多種生理類型，很可能通過(guò)改變代謝途徑適應(yīng)重金屬污染的環(huán)境。可見(jiàn)，生理生化指標(biāo)可以作為初步篩選高抗性菌株的參考指標(biāo)。

３結(jié)論

通過(guò)對(duì)分離自蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)的１０株豆科植物根瘤菌的鉛鋅響應(yīng)試驗(yàn)及生理生化指標(biāo)的測(cè)定，篩選到３株對(duì)鉛鋅雙鹽脅迫有較強(qiáng)的耐（抗）能力的菌株，分別為菌株３．２．３、１８．２．１７、１４．２．９，其中菌株３．２．３可耐受１ ０００ ｍｇ／Ｌ Ｐｂ２＋＋１ ６００ ｍｇ／Ｌ Ｚｎ２＋，是與香豌豆共生的鉛鋅高耐（抗）性菌株。鉛鋅共同作用時(shí)，低濃度鋅（＜８００ ｍｇ／Ｌ）可以緩解鉛對(duì)微生物的毒害作用。根瘤菌的鉛鋅耐性可能與生理生化特征相關(guān)，細(xì)胞通過(guò)代謝途徑發(fā)生變化來(lái)增加對(duì)鉛鋅的抗性，適應(yīng)環(huán)境。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 張霖，和秀林． 蘭坪—神奇美麗的寶地［Ｊ］．創(chuàng)造，１９９９（５）：５５．

［２］ ＳＯＲＥＮＳＥＮ Ｄ Ｌ， ＦＲＥＳＱＵＥＺ Ｐ Ｒ． Ｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｒｅｃｌａｉｍｅｄ ｃｏａｌ ｍｉｎｅ ｓｐｏｉｌｓ ａｎｄ ｓｏｉｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｍｉａｒｉｄ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ，１９９１，２０（１）：２７９－２８５．

［３］ 簡(jiǎn)曙光，楊中藝． 莖瘤對(duì)長(zhǎng)喙田菁在鉛鋅尾礦環(huán)境適應(yīng)中的意義—Ｉ．莖瘤對(duì)長(zhǎng)喙田菁生長(zhǎng)發(fā)育的影響［Ｊ］． 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，２００２，２６（１）：９６－１００．

［４］ 聶湘平，藍(lán)崇鈺，張至權(quán)，等． 銅對(duì)大葉相思-根瘤菌共生固氮體系的影響［Ｊ］． 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，２００２，１３（２）：１３７－１４０．

［５］ 繆福俊，熊智，孫浩，等． 蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)豆科植物根瘤菌耐受性研究［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１０，３８（２１）：１１３６５－１１３６７，

１１４２６．

［６］ 沈萍，陳向東． 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［Ｍ］． 第四版． 北京：高等教育出版社，２００７．

［７］ 徐開未，張小平，陳遠(yuǎn)學(xué)，等． 金沙江干熱河谷區(qū)山螞蝗屬根瘤菌抗逆性研究［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（２）：５０１－５０３．

［８］ 束文圣，葉志鴻，張志權(quán)，等． 華南鉛鋅尾礦生態(tài)恢復(fù)的理論與實(shí)踐［Ｊ］． 生態(tài)學(xué)報(bào)，２００３，２３（８）：１６２９－１６３９．

［９］ ＦＬＩＥβＢＡＣＨ Ａ， ＭＡＲＴＥＮＳ Ｒ， ＲＥＢＥＲ Ｈ Ｈ． Ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｓｏｉｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｅｗａｇｅ ｓｌｕｄｇｅ［Ｊ］． Ｓｉｏｌ Ｂｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４，

２６（９）：１２０１－１２０５．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文