重組人膠原蛋白肽的表達及純化工藝的優化

摘要：將重組大腸桿菌ｐＣ６－ＢＬ２１活化后，用ＩＰＴＧ誘導表達，探討了大腸桿菌中重組膠原蛋白肽的最佳表達及純化條件。結果表明，菌株在３７ ℃，接種量為２％，搖瓶培養３．０ ｈ后，加入終濃度為０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，３０ ℃誘導５．０ ｈ，收獲的蛋白產量最高，經Ｎｉ－ＮＴＡ柱親和層析純化，用梯度咪唑緩沖液洗脫蛋白，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑緩沖液洗脫蛋白為純蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析顯示該表達產物與人ＣＯＬ６Ａ２單克隆抗體有特異結合能力。

關鍵詞：重組人膠原蛋白肽；純化；表達

中圖分類號：Ｑ８１６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）13－2768-04

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ

ＷＵ Ｍｉｎｇ，ＸＵ Ｚｈｅｎ－ｚｈｅｎ，ＷＡＮＧ Gａｎｇ，ＳＵＮ Ｙａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｇｕａｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１８， Jilin，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ recombinant hｕｍａｎ cｏｌｌａｇｅｎ pｅｐｔｉｄｅ（ＣＰ６） ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＣ６－ＢＬ２１， ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｉｎｄｕｃｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＣＰ６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ａｔ ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ２％， ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗere ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｆｏｒ ３.0 ｈ ａｔ ３７ ℃； ｔｈｅｎ ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ａｓ ｉｎｄｕｃｅｒ； ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｕｎｄｅｒ ３０ ℃ ｆｏｒ ５．０ ｈ． Ａｆｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｎｉｃｋｅｌ ｉｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ； ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｆ ｅｌｕｔｅｄ ｂｙ １５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ， aｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＯＬ６Ａ２．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： rｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ hｕｍａｎ cｏｌｌａｇｅｎ pｅｐｔｉｄｅ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

膠原蛋白是一類廣泛分布于動物結締組織的蛋白質［１］，對維護機體的正常生理功能和損傷修復有重要作用。目前膠原蛋白的生產主要是用酸、堿水解法從動物結締組織提取，提取過程中會或多或少地喪失膠原蛋白的生物活性，應用于人體時還可能會產生排異反應，且存在著極大的病毒隱患［２，３］。鑒于膠原蛋白有廣闊的應用前景，特別是醫用材料、保健品領域迫切需要大量優質的膠原蛋白，尋找新的安全可靠的手段制備膠原蛋白十分重要，利用基因工程手段重組表達人膠原蛋白成為研究熱點［４－６］。本實驗以ＬＢ培養基為基礎，采用單因素實驗對重組人膠原蛋白在大腸桿菌中誘導表達的一系列條件，如接種量、誘導時機、誘導物濃度、誘導溫度和表達時間等進行了優化［７］，并對所得的膠原蛋白進行了純化和鑒定，為進一步研究發酵工藝提供了實驗基礎。

１材料與方法

１．１材料和試劑

實驗菌種為重組大腸桿菌ｐＣ６－ＢＬ２１（ＤＥ３），由吉林農業大學生物物理實驗室構建并保存。質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、ＩＰＴＧ（異丙基硫代半乳糖苷）、蛋白胨（ＯＸＯＩＤ）、酵母提取物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，ＹＥ）均購自北京鼎國生物工程有限公司；Ｎｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓ·Ｂｉｎｄ樹脂和Ｎｉ－ＮＴＡ緩沖液試劑盒均購自ＭＥＲＣＫ公司，其他試劑和藥品均為國產分析純。

１．２表達條件的優化

挑取一環－８０ ℃、２５％甘油保存的工程菌，接種于ＬＢ固體培養基中，３７ ℃培養２４ ｈ，然后挑單菌落于１００ ｍＬ ＬＢ液體培養基中，３７ ℃，２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養過夜，以活化菌種。活化后按不同接種量、誘導時機、誘導物ＩＰＴＧ濃度、誘導溫度和表達時間設置單因素實驗，誘導膠原蛋白的表達，單因素實驗每個處理設置３個重復。①接種量：設置１％、２％、３％、４％、５％ ５個接種量水平，將活化的菌種接種到含有５０ ｍＬ ＬＢ培養基的２５０ ｍＬ的三角燒瓶中，３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養４．０ ｈ至ＯＤ６００為０．７時，加入終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ誘導，３７ ℃發酵培養４．０ ｈ；②誘導時機：將過夜活化的種子液按２％的接種量接種于５０ ｍＬ ＬＢ培養基中，３７ ℃，２００ ｒ／ｍｉｎ分別培養１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ ｈ后加入終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ進行誘導，３７ ℃發酵培養４．０ ｈ；③ＩＰＴＧ濃度：活化的菌種接種后在３７ ℃培養２．５ ｈ后加入ＩＰＴＧ至終濃度分別為０．１、０．３、０．５、０．７、１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，分別誘導培養５．０ ｈ；④誘導溫度：按最佳接種量和最佳誘導物濃度，在不同的誘導溫度下（２８、３０、３３、３７ ℃）誘導膠原蛋白的表達，確定最佳誘導溫度；⑤表達時間：使用①～④所得的實驗條件，分別在菌種誘導表達后２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０ ｈ取樣，以確定最佳表達時間長度。

１．３重組蛋白含量的測定

①細胞密度測定：發酵液經稀釋１～１０倍后，用可見分光光度計在６００ ｎｍ處測其光吸收值。②重組蛋白含量的測定：工程菌發酵結束后，取５０ ｍＬ經誘導的搖瓶培養發酵液，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１ ｍｉｎ，用０．５ ｍＬ ｐＨ值為７．４、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液洗滌沉淀，吸凈上清液。用１～５ μＬ的蒸餾水重懸菌體，并立即加入等量的２×ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝膠加樣緩沖液，混勻后，沸水浴５ ｍｉｎ。吸取裂解后的樣品液作聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染色測定菌體總蛋白后，采用Ｂａｎｄｓｃａｎ軟件掃描ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖，分析出每條泳道重組蛋白占菌體總蛋白的百分含量并計算出重組蛋白含量。

１．４表達產物的分離純化

菌體經超聲破碎后離心，上清經Ｎｉ－ＮＴＡ柱親和層析，用１０倍體積２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（含０．３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ ８．０）平衡柱體，然后分別用６０、１００、１２０、１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ的咪唑緩沖液（ｐＨ ８．０）進行梯度洗脫，收集各個洗脫峰，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析收集的成分。

１．５重組蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鑒定

將純化的重組蛋白進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，轉印至醋酸纖維素膜上，然后將膜在含５％的ＰＢＳ中室溫封閉２.0 ｈ，洗膜后加入小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２的單克隆抗體（１∶２ ０００稀釋）在４ ℃放置２.0 ｈ，洗膜后再加入羊抗鼠ＩｇＧ－ＨＲＰ（１∶２ ０００稀釋）在４ ℃放置２.0 ｈ，充分漂洗后加入化學發光底物Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ檢測試劑，暗室Ｘ光片暗匣曝光、顯影。

２結果與分析

２．１接種量的優化

從圖１可以看出，菌體的生物量隨著接種量的增加而提高，而重組蛋白產量在接種量為２％時最高，繼續增大接種量，其產量反而下降。這可能是由于接種量增加導致菌體生長過快過稠，造成營養基質缺乏或溶解氧不足而不利于發酵產蛋白［８］。考慮到在大規模發酵過程中，接種量過小會導致菌體增殖緩慢，而接種量過大對菌體生長和酶轉化得率會產生一定抑制作用，確定２％為最佳接種量。

２．２ＩＰＴＧ誘導時機的優化

誘導時機對目的蛋白表達效果的影響比較大（圖２），培養３．０ ｈ后，即對數生長中后期再添加誘導劑，蛋白的表達量最高。過早添加誘導劑會抑制菌體的增殖，導致生物量減少，在培養時間內獲得的表達量也就低；過晚添加誘導劑，菌體已處于生長穩定期，培養基內營養成分減少，細胞代謝速度減緩，合成蛋白的能力降低，表達量也會減少。因此選擇在對數生長中后期即培養３．０ ｈ后加入誘導劑。

２．３ＩＰＴＧ誘導濃度的優化

如圖３所示，不同濃度的ＩＰＴＧ對外源蛋白的表達有一定的影響。低濃度條件下，隨著ＩＰＴＧ的濃度增加，外源蛋白的表達量也增加，在ＩＰＴＧ濃度為０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ時達到最大值，此后隨著ＩＰＴＧ濃度的增加表達量反而下降。由于高濃度的ＩＰＴＧ會對菌體生長造成毒害作用，同時為了節約成本，選擇０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ為最適誘導濃度。

２．４誘導溫度的優化

過低或過高的溫度都會使菌體代謝緩慢，不利于外源基因的表達［９］。實驗結果（圖４）表明，隨著溫度升高，收獲的菌體生物量先升后降，在３０ ℃時菌體生物量最高。而重組蛋白的表達隨著溫度的升高而加強，在３７ ℃時最高，因此選擇３７ ℃為最佳誘導溫度。

２．５表達時間的優化

如圖５所示，誘導５．０ ｈ時蛋白表達量和生物量均達到最大值。繼續誘導，生物量和表達量均下降。收集時間過早，蛋白的表達還不充分，收集時間過遲則可能導致細胞老化，自溶，發酵液中雜蛋白多，不利于純化，綜合考慮確定最佳誘導時間為５．０ ｈ。

２．６目的蛋白的分離純化

大量誘導表達融合蛋白，經超聲破碎、離心后，收集上清液，經Ｎｉ－ＮＴＡ柱親和層析提純重組蛋白，用梯度咪唑緩沖液洗脫蛋白，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑緩沖液洗脫蛋白為純蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測見圖６，重組蛋白相對分子質量約為４６ ｋｕ，與預期相符。

２．７重組蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鑒定

Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（圖７）分析顯示，１號泳道空白對照無特異性反應條帶，而２號泳道中純化產物與小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２的單克隆抗體有特異性反應。

３結論

本實驗研究了不同的培養條件對重組蛋白表達的影響，結果表明接種量對重組蛋白表達影響較大，當接種量過大時，會直接影響菌體生長狀態，從而抑制重組蛋白的表達；ＩＴＰＧ有毒性，培養基中ＩＰＴＧ濃度過低會使誘導力度不夠，蛋白表達少，過高則可能會影響菌體生長；誘導時機和誘導后的培養時間都對目的蛋白的產量有重要的影響。確定了重組蛋白表達的最佳培養條件：接種量為２％，培養３．０ ｈ后添加終濃度為０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＴＰＧ，３７ ℃下誘導表達５．０ ｈ，表達的重組蛋白含量最高。本研究使用重組質粒ｐＥＴ２２ｂ－ＣＰ６轉化的大腸桿菌ｐＣ６－ＢＬ２１（ＤＥ３），經ＩＰＴＧ誘導表達，得到可溶性重組蛋白，經Ｎｉ－ＮＴＡ柱親和層析純化獲得重組蛋白，方法簡單易行。本實驗的結果為進一步在發酵罐內進行分批發酵和補料發酵提供了參考。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文