趨化因子受體CXCR4在神經膠質瘤中的表達及其臨床意義

叢璐璐，胡紅超，焦保華

（河北醫科大學第二醫院神經外科，河北石家莊 050000）

趨化因子受體CXCR4在神經膠質瘤中的表達及其臨床意義

叢璐璐，胡紅超，焦保華*

（河北醫科大學第二醫院神經外科，河北石家莊 050000）

目的觀察CXCI4在正常腦組織及各級神經膠質瘤組織中的表達情況，探討其與膠質瘤的侵襲性、病理級別及血管生成的關系。方法采用免疫組織化學方法測定5例正常腦組織及3S例膠質瘤組織中CXCI4、CD34的表達，實時熒光定量PCI法測定CXCI4mINA的相對表達量。結果CXCI4在正常腦組織中陰性表達，膠質瘤組織中陽性表達率為63.16%，各病理級別組的陽性表達率及相對表達量差異均有統計學意義（P＜0.05），且均隨級別增加而升高；CD34單克隆抗體標記的微血管密度（microveSSel denSity，MVD）在正常腦組織和腦膠質瘤組中的表達均值分別為3.76±0.4S和35.25±9.75，在各級別組中的表達均值差異均有統計學意義（P＜0.01）并隨級別增加而升高；MVD在CXCI4表達陰性和陽性的膠質瘤組織中表達均值分別為26.37±5.11和40.43±7.SS，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論CXCI4與膠質瘤的侵襲性及惡性程度有關并可能參與膠質瘤的新生血管生成；MVD可作為判定腫瘤惡性程度和預后的重要指標。

受體，趨化因子；神經膠質瘤；免疫組織化學

神經膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，具體發生機制不清，傳統的治療方法效果不佳。趨化因子受體CXCI4屬于G蛋白偶聯受體（Gproteincoupled receptor，GPCI）超家族成員，研究表明［1］CXCI4在多種腫瘤中表達，特異性封閉CXCI4可抑制成瘤率。因此研究CXCI4在神經膠質瘤細胞中的表達及與血管生成的關系，對于探究以趨化因子受體為靶點的治療策略具有十分重要的意義。本研究旨在通過研究趨化因子受體CXCI4在神經膠質瘤各病理級別中的表達情況，來分析其表達與神經膠質瘤侵襲性的內在關系及其與微血管密度（microveSSel denSity，MVD）的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：標本來源于河北醫科大學第二醫院神經外科2009年10月—2010年3月經手術切除的資料完整的神經膠質瘤患者的手術標本3S例，其中男性22例，女性16例，年齡4～62歲，平均（46.12±17.13）歲。所有患者均為首發病例，術前未行放化療等治療手段，所有組織均行病理組織學檢查確診，并按照WHO腦腫瘤分類、分級標準進行臨床病理分級。其中Ⅱ級1S例，Ⅲ級12例，Ⅳ級S例。為了方便統計，將Ⅱ級歸為低級別組，Ⅲ～Ⅳ級歸為高級別組。另取5例需行顱內減壓術患者的正常腦組織標本作為對照，男性4例，女性1例，年齡26～65歲，平均（4S.S0±14.S2）歲。

1.2 主要試劑：兔抗人CXCI4單克隆抗體購自美國EPITOMICS公司，按1∶100稀釋備用；鼠抗人原始造血細胞（CD34）單克隆抗體工作液及濃縮型DAB試劑購自北京中衫金橋生物技術有限公司；兔免疫組織化學試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；小鼠SP染色試劑盒購自美國ZYMED公司；Trizol、反轉錄及擴增試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；PCI引物及β-action由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學SP法實驗步驟

1.2.1.1 腫瘤組織HE染色及免疫組織化學染色：標本以4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，5μm厚連續切片，先行HE染色，然后按試劑盒說明書進行SP法免疫組織化學染色，微波爐熱修復，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，以PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.1.2 結果判定：①CXCI4結果判定，CXCI4免疫反應陽性物質呈棕黃色顆粒，定位于細胞胞膜及細胞漿，核不著色。參考相關文獻［2］采用陽性細胞百分比結合顯色強度法判讀結果。②MVD的測定，參照Weidner［3］報道的方法進行測定，瘤組織內任何被抗CD34抗體染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇，有或無管腔，只要與其他組織成分有明顯區別，均計為1個陽性血管標記，避開腫瘤壞死或出血區域，計算MVD測定值。

1.2.2 實時熒光定量PCI實驗步驟：無菌操作下收集新鮮組織迅速凍存于-S0℃冰箱，以Trizol試劑按照說明書提取組織總INA，進行INA濃度、純度和完整性測定。按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，反轉錄條件為，37℃15 min；S5℃5S。熒光定量PCI檢測目的基因的相對表達，依參考文獻［4］，目的基因的引物序列及擴增片段長度如下，CXCI4上游引物，5ˊ-AATCTTC CTGCCCACCATCT-3ˊ，下游引物，5ˊ-GACGCCAACATAGACCACCT-3ˊ，擴增片段長度367bp。β-actin上游引物，5ˊ-GGACTTCGAGCAAGA GATGG-3ˊ，下游引物，5ˊ-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3ˊ，擴增片段長度220bp。擴增條件為，95℃10 min，40個循環（95℃15S，60℃1min）。PCI產物經2%瓊脂糖凝膠電泳驗證，以β-actin作為內參基因，△△Ct法分析基因的相對表達。

1.3 統計學方法：采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗或tˊ檢驗，計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 趨化因子受體CXCI4在蛋白水平的表達（圖1，2）：CXCI4在正常腦組織中表達陰性，在24例膠質瘤組織中表達呈陽性，總陽性表達率為63.16%，在低級別和高級別膠質瘤組的陽性表達率分別為44.44%、S0.00%。CXCI4陽性表達率隨著膠質瘤病理級別的增高而呈上升趨勢，且高級別組CXCI4的陽性表達率明顯高于低級別組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 CXCR4在正常腦組織和膠質瘤組中的表達Table 1 The expression of CXCR4 in normal brain and gliomas （n）

2.2 趨化因子受體CXCI4mINA的相對表達量：CXCI4mINA在低級別和高級別膠質瘤組中的相對表達量分別為2.22±0.S0和4.03±1.9S，其趨勢為隨膠質瘤病理級別的增高而升高，差別有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 CXCR4 mRNA在腦膠質瘤中的相對表達量Table 2 The relative expression of CXCR4mRNA in gliomas （±s）

表2 CXCR4 mRNA在腦膠質瘤中的相對表達量Table 2 The relative expression of CXCR4mRNA in gliomas （±s）

GroupSnCXCI4mINA relative expreSSiont’P Low differentiated1S2.22±0.S0 High differentiated204.03±1.9S -3.7S＜0.05

2.3 以CD34單克隆抗體標記的MVD測定結果（圖3，4）：MVD在正常腦組織和腦膠質瘤組中的表達均值分別為3.76±0.4S和35.25±9.75，差異有統計學意義（P＜0.01）；MVD在低級別膠質瘤組和高級別膠質瘤組中的表達均值分別為27.3S±5.04 和42.34±7.12，差異有統計學意義（P＜0.01），見表3。

表3 MVD在膠質瘤組和正常腦組織中的測定值Table 3 MVD in gliomas and normal brain tissue （±s）

表3 MVD在膠質瘤組和正常腦組織中的測定值Table 3 MVD in gliomas and normal brain tissue （±s）

MVD：microveSSel denSity

GroupSnMVDt（tˊ）P Normal brain53.76±0.4S GliomaS3S35.25±9.75-19.74＜0.01 Low differentiated（Ⅱ）1S27.3S±5.04 High differentiated（Ⅲ、Ⅳ）2042.34±7.12-7.40＜0.01

2.4 CXCI4的表達與MVD的關系：MVD在14例CXCI4表達陰性的膠質瘤組織中的表達均值為26.37±5.11，在24例CXCI4表達陽性的膠質瘤組織中的表達均值為40.43±7.SS，差異有統計學意義（P＜0.01），見表4。

表4 CXCR4的表達與MVD值的關系Table 4 The correlation between expression of CXCR4 and MVD （±s）

表4 CXCR4的表達與MVD值的關系Table 4 The correlation between expression of CXCR4 and MVD （±s）

CXCI4nMVDt’P -1426.37±5.11+～++2440.43±7.SS -6.66＜0.01

3 討 論

神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，具有生長迅速、侵襲性強等生物學特性［5］。腫瘤區域有許多重要的神經功能要進行保護，因此傳統的手術切除幾乎無法切除所有的腫瘤細胞，術后復發快、預后差。隨著對神經膠質瘤發病機制的深入研究以及分子生物學技術的快速發展，分子靶向治療逐漸成為一種具有廣闊前景的治療新手段。

趨化因子是一類對免疫細胞起趨化作用的促炎因子，它們能使細胞沿著濃度梯度朝高濃度刺激物的方向發生定向移動。根據其形成的二硫鍵的4個保守半胱氨酸的位置可分為4類，CC趨化因子、CXC趨化因子、CX3C趨化因子和C趨化因子。趨化因子只有與靶細胞上相應的特定受體結合才能發揮作用，參與機體的各種生理病理反應。

趨化因子受體屬于GPCI超家族，是一種特殊的G蛋白，均含有7個跨膜區域，通過與G蛋白相關聯來介導趨化因子對其靶細胞的特異效應。趨化因子受體根據結合配體的不同也可相應的分為四類，CXCI，CCI，XCI和CX3CI，其中以CXCI與腫瘤血管生成的關系最為密切［6］，CXCI4可能參與了促血管生成的作用。

我們通過免疫組織化學染色法對膠質瘤組織中CXCI4的表達情況進行檢測，結果顯示CXCI4在5例正常腦組織中表達陰性，而在3S例腦膠質瘤組織中的表達率為63.16%，在高級別膠質瘤組中的表達率較低級別的表達率顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；同時采用實時熒光定量PCI實驗方法測定趨化因子受體CXCI4mINA的相對表達量，其實驗結果與免疫組織化學染色的結果具有一致性。從蛋白和分子水平同時證實了CXCI4在膠質瘤中是有功能性的，其表達與膠質瘤的病理分級、侵襲性有關系，并且可能CXCI4表達陽性的膠質瘤細胞是更具侵襲能力的亞群，且惡性程度較高。

血管生成是指在原有血管基礎上的新生血管生成，其過程的核心是取決于血管內皮細胞生存和凋亡平衡的結果。腫瘤以異常增生為特點，而過度增生的腫瘤組織需要更多的營養，必然會有新生血管的生成才能滿足腫瘤生長所需的營養。實體腫瘤若無新生血管，僅能自發生長至直徑2mm體積，此為周邊血管物質滲透范圍所及，其繼續生長則有賴于新生血管生成［9］。當實體腫瘤直徑＞2mm后，其生長就必須依靠新生血管為其提供營養物質和氧，排除代謝廢物，并為腫瘤細胞的播散提供最直接的通道，尤其是惡性實體腫瘤的生長必須依賴新生血管持續不斷地為其提供營養和排除代謝產物。

腫瘤組織誘導的血管生成不僅為實體腫瘤的后續生長及轉移提供了生物物質基礎，而且腫瘤血管生成的本身具有一定侵襲性，瘤細胞可沿由新生血管開啟的組織裂隙，向外侵襲周圍組織。而腫瘤微血管在病理生理、形態功能方面的特征性，也為腫瘤細胞成功逃避機體免疫監測和細胞毒性藥物的化療提供了"屏障"基礎；總之，血管生成與腫瘤的發生、發展、侵襲及預后有著密切的關系。

一般認為，腫瘤的MVD既可作為反映血管生成程度的指標，又可作為反映膠質瘤預后的一項獨立指標。而CD34是血管內皮細胞標記物中較敏感的指標，其在新生血管內皮中的表達遠大于非新生血管內皮。

因此本文利用抗內皮細胞CD34單抗來標記正常腦組織和膠質瘤組織中的微血管，從而對其進行計數來測定MVD值。結果顯示，腦膠質瘤標本中的MVD值顯著高于正常腦組織，并且高級別膠質瘤組中的MVD值較低級別膠質瘤組顯著增加，表明低惡性度膠質瘤的MVD偏低可能同分化較好的腫瘤細胞能對原有血管充分利用有關，腫瘤細胞在向外生長過程中，血管新生是同步進行的，新生血管化程度與腫瘤的進展有關。因此我們可以認為MVD可作為反映膠質瘤惡性程度的指標。

近年來，趨化因子及其受體在腫瘤血管生成中的作用及機制受到越來越多的關注。趨化因子對腫瘤的血管生成的調節具有刺激生成和抑制增生雙向作用，兩者之間的平衡決定著腫瘤的發生、發展。已有研究［10］顯示CXCI4可能參與了促血管生成作用，膠質瘤細胞所表達的CXCI4是功能性的，活化后可能通過上調血管內皮生長因子的表達在CXCI4介導膠質瘤侵襲和血管生成上起重要作用，并且CXCI4的活化可導致膠質瘤細胞的趨化和血管內皮細胞生長因子的合成增加。

本結果提示CXCI4可能與膠質瘤細胞惡性程度及侵襲性有關，而且還可能與血管生成有關，結果顯示代表膠質瘤血管生成情況的MVD值在趨化因子受體CXCI4表達陰性和陽性的膠質瘤組織中的表達差異有統計學意義（P＜0.01），提示CXCI4可能參與膠質瘤的新生血管生成。

綜上所述，趨化因子受體CXCI4與膠質瘤的發生、發展及血管生成密切相關。深入研究CXCI4受體的功能和作用機制將為腫瘤的綜合治療提供理論和實踐的指導意義，并且CXCI4可作為臨床判斷膠質瘤侵襲性的輔助指標及預后指標，指導臨床醫生采取更有效的術后輔助治療。（本文圖見封二）

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EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF CHEMOKINE RECEPTOR CXCR4 IN GLIOMA

CONG Lu-lu，HU Hong-chao，JIAO Bao-hua*
（Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo obServe the expreSSion of CXCI4 in normal brain tiSSue and all grade gliomaS，analyze the internal relationS between the expreSSion of chemokineS receptorS CXCI4 and invaSiveneSS of glioma，pathological grade and angiogeneSiS.MethodsThe expreSSion of CXCI4 protein and CD34 were examined by immunohiStochemiStry in 5 normal brain tiSSue SpecimenS and 3S glioma tiSSue SpecimenS，the relative expreSSion of chemokineS receptorS CXCI4 waS detected in glioma tiSSue Specimen by quantitative real-time PCI.ResultsThe chemokineS receptorS CXCI4 waS negatively expreSSed in normal brain tiSSueS，the total poSitive expreSSion rateS in tumor group waS 63.16%，the poSitive expreSSion rateS and the relative expreSSion of CXCI4 haS Significant difference between different grade gliomaS（P＜0.05），and increaSed with the pathological grade of glioma；the CD34 monoclonal antibody-labeled-microveSSel denSity（MVD）in normal brain tiSSue group and tumor group reSpectively were 3.76±0.4S and 35.25±9.75，the value had Significant difference between different grade gliomaS（P＜0.01），and increaSed with the pathological grade of glioma；The expreSSion average of MVD reSpectively were 26.37±5.11and 40.43±7.SS in negative expreSSion and poSitive expreSSion of CXCI4 in glioma tiSSueS，the data had very Significant difference（P＜0.01）.ConclusionCXCI4 iS related to the invaSiveneSS and the malignancy of glioma，and might take part in the angiogeneSiS of glioma；MVD can be uSed aS an important indicator of determining malignancy and prognoSiS of tumor.

recepterS，chemokine；glioma；immunohiStochemiStry

I739.41

A

1007-3205（2011）07-0770-04

2011-04-2S；

2011-06-20

叢璐璐（19S4-），女，山東文登人，河北醫科大學第二醫院醫學碩士研究生，從事腦膠質瘤診斷與治療研究。

*通訊作者

10.3969/j.iSSn.1007-3205.2011.07.010