伯樂樹ISSR分子標記體系的建立

謝正成，樓雄珍，姚理武，黃華宏*，林二培，駱文堅，陳春梅

（1. 浙江省慶元縣林業局，浙江 慶元 323800；2. 浙江農林大學，浙江 臨安 311300；3. 浙江省林業種苗管理總站，浙江 杭州 310020）

伯樂樹ISSR分子標記體系的建立

謝正成1，樓雄珍2，姚理武1，黃華宏2*，林二培2，駱文堅3，陳春梅1

（1. 浙江省慶元縣林業局，浙江 慶元 323800；2. 浙江農林大學，浙江 臨安 311300；3. 浙江省林業種苗管理總站，浙江 杭州 310020）

從浙江省慶元縣等地采集23份野生伯樂樹單株葉片為試驗材料，采用單因素對比試驗和正交優化試驗研究了模板DNA、Taq DNA聚合酶的用量，以及Mg2+、dNTP、引物濃度和退火溫度對PCR擴增的影響，建立伯樂樹適宜的ISSR-PCR擴增體系，即20μL體系中含90 ng模板DNA，1×PCR buffer，1.0 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTP，0.5μmol/L引物，0.75U Taq DNA聚合酶，退火溫度為50℃。

伯樂樹；ISSR；分子標記

伯樂樹（Bretschneidera sinensis）又名鐘萼木，屬伯樂樹科，是我國特有的、古老的單種科和殘遺種，零散分布于浙江南部、臺灣、福建、湖南、湖北、廣東、廣西和四川等省，處于瀕危狀態，已被國家列為一級保護植物。它在研究被子植物的系統發育和古地理、古氣候等方面都有重要科學價值。同時，其樹姿挺拔，花果艷麗，且木材硬度適中，紋理直，結構細密，是優良的園林綠化樹種和用材樹種。目前，有關伯樂樹的研究較少，僅限于生物學特性[1～2]、群落特征[3]、種子貯藏與育苗[4～7]以及組織培養[8～9]等方面，而利用分子技術對其進行系統研究尚未見報道。

Zietkiew icz等于1994年創建的簡單重復序列區間（Inter-Simple Sequence Repeat, ISSR）[10]標記已廣泛應用于植物品種鑒定[11]、遺傳多樣性分析[12～13]、指紋圖譜和分子遺傳圖譜構建[14～16]等研究。實驗中ISSR標記會受到多種反應條件的影響，不同物種對反應的要求也不盡相同[17～18]。因此，在運用該技術進行分析時，首先需要建立效果好且穩定的反應體系。本文以我國特有的珍稀瀕危樹種伯樂樹為材料，對影響ISSR擴增效果的主要因素模板DNA、Taq DNA聚合酶的用量，Mg2+、dNTPs、引物的濃度，以及退火溫度進行探討，擬建立適用于伯樂樹的最佳ISSR-PCR技術體系，從而為其天然群體遺傳多樣性分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試材為23份野生伯樂樹單株葉片，分別編號為1～23，其中19份取自浙江的慶元、龍泉、景寧、泰順等縣，4份取自江西龍南的九連山，硅膠干燥保存。

1.2 主要儀器與試劑

PCR擴增反應在HYBAID公司生產的PCRexpress擴增儀上進行；電泳儀、電泳槽以及凝膠成像系統由Bio-Rad公司生產。PCR擴增所用的Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、10×PCR 緩沖液、M gCl2（25 mmol/L）、dNTPs（各2.5 mmol/L）以及標準分子量DNA（DL2000）等購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；電泳所用主要試劑Tris、瓊脂糖等購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3 方法

1.3.1 伯樂樹DNA的提取及檢測 采用改進后的CTAB微量法提取伯樂樹基因組DNA。用NanoDrop微量分光光度計測量所提DNA純度和濃度，同時用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA是否降解。

1.3.2 PCR擴增及實驗設計 以來自浙江慶元的1號伯樂樹葉片DNA為模板，綜合考慮ISSR技術在銀杏[11]、茶樹[15]、五針松[17]等植物上各成分的用量，設定原始反應體系：20μL體系中10×PCR 緩沖液2.0μL、Mg2+2.5 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、引物0.5μmol/L、Taq 酶1.0 U、DNA 50 ng。

根據預備實驗的結果，以擴增較好的通用引物UBC817、823、824、834作為基因組DNA擴增引物，采用單因素實驗設計方法，對ISSR反應體系中的DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物濃度、Taq DNA聚合酶5種主要成分進行分析（20μL反應體系中各成分優化設計方案見表1）。在此基礎上，進一步對這5種成分開展正交優化，選用L16（45）正交表，設計方案見表2。另外，對影響PCR結果的退火溫度也進行對比篩選。

擴增反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，退火溫度（依引物而定）40 s，72℃延伸90 s，35個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 單因素優化設計方案Table 1 Single factor design for PCR

表2 ISSR-PCR正交試驗設計[L16（45）]Table 2 Orthogonal design for ISSR-PCR

1.3.3 ISSR-PCR產物檢測 用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，在Bio-Rad凝膠成像系統進行觀察和拍照。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取結果

所提伯樂樹DNA的OD260/OD280值為1.80～2.09，表明DNA純度較好。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現點樣孔清晰，條帶完整（圖1），無RNA污染。因此，本實驗提取DNA質量較好，適合用于ISSR-PCR擴增。

圖1 8個伯樂樹樣品DNA的電泳結果Figure 1 Electrophoresis results of eight DNA samples ofB. sinensis

2.2 模板DNA用量對ISSR反應的影響

從圖2可以看出，實驗中各模板用量都獲得了比較清晰的擴增產物。同時，隨著DNA用量增大，主要條帶亮度有所增強，且弱帶也逐漸清晰，當用量為30～120 ng時，擴增效果相對理想。

2.3 Mg2+濃度對ISSR反應的影響

Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，Mg2+濃度對其催化活性和催化產物有明顯影響。從圖3可看出，Mg2+濃度在0.625～5.0 mmol/L均有擴增產物。濃度為0.625時，表現部分條帶缺失，在3.125～5.0 mmol/L時，出現條帶模糊，而在1.25～2.5 mmol/L有較好的擴增，但比較發現1.25和1.875 mmol/L處擴增條帶更清晰穩定，且比原始反應體系中的用量（2.5 mmol/L）低。

圖2 不同模板DNA用量對PCR反應的影響Figure 2 Effect of different concentration of DNA template on PCR

2.4 dNTPs濃度對ISSR反應的影響

dNTPs 是PCR 的原料，濃度過高或過低都會對擴增結果產生影響。圖4顯示：dNTPs 濃度在0.025～0.225 mmol/L時，都得到了擴增產物，但在0.025 mmol/L時出現擴增譜帶部分缺失，在0.2、0.225 mmol/L時出現條帶模糊，比較而言，在0.1～0.15 mmol/L時擴增條帶更為清晰且穩定。

圖3 不同Mg2+濃度對PCR反應的影響Figure 3 Effect of different concentration of Mg2+on PCR

圖4 不同dNTP濃度對PCR反應的影響Figure 4 Effect of different concentration of dNTPs on PCR

2.5 引物濃度對ISSR反應的影響

引物濃度也是影響PCR擴增效果的重要因素。實驗中設置了0.1～0.9μmol/L共9個梯度。從圖5可看出，在9個濃度下都得到擴增，其中在0.1和0.9μmol/L時擴增不理想，出現部分主要條帶弱且模糊，在0.2～0.8 μmol/L皆得到了4個主要條帶，且大小一致，而引物濃度為0.4、0.5μmol/L時表現相對清晰。

2.6 Taq酶用量對ISSR反應的影響

Taq DNA聚合酶的用量是PCR反應中最為重要的影響因子之一，當用量過多易產生非特異性擴增，而用量太低又得不到擴增產物。由圖6可知，當Taq DNA聚合酶的用量為0.25U時沒得到擴增，而在0.5～2.0U主要條帶都被擴增出來，且大小一致。

圖5 不同引物濃度對PCR反應的影響Figure 5 Effect of different concentration of prime on PCR

圖6 Taq酶用量對PCR反應的影響Figure 6 Effect of different concentration of Taq DNA polymerase on PCR

2.7 ISSR反應體系的正交優化結果

在單因素試驗的基礎上，同時考慮ISSR-PCR主要反應成分間的交互作用，進一步進行正交優化實驗。圖7為以UBC817為引物的正交試驗結果。從圖中可看出，處理9、10得到的條帶相對清晰，雜帶少且穩定。而其他處理表現出條帶模糊或缺失，或是出現非特異性擴增，都不符合預期的目標。綜合考慮單因素對比試驗結果，選擇處理9作為最佳的反應體系。

2.8 退火溫度對ISSR反應的影響

除反應體系中的各成分外，ISSR-PCR擴增程序中的變性、退火、延伸溫度和時間，以及循環數也會影響PCR結果，其中以退火溫度的影響較大。圖8所示為引物UBC834在不同退火溫度下的擴增結果。從42.1～56.7℃的14.6℃溫度間隔里，在退火溫度為42.1～46.4℃時，擴增出的一些條帶亮度弱且模糊不清，48.4、50.3℃時擴增出的條帶清晰明亮，而高于52.3℃時出現條帶模糊且部分條帶缺失。本實驗選擇50℃為引物834的適宜退火溫度。

圖7 正交試驗PCR產物電泳結果Figure 7 Electrophoresis of orthogonal design PCR products

圖8 不同退火溫度對PCR反應的影響Figure 8 Effect of different annealing temperature on PCR

2.9優化體系的應用

利用上述實驗得到優化體系對23份野生伯樂樹單株進行ISSR擴增，擴增結果如圖9所示，引物UBC823將所有23個單株的帶型完全擴增出來，譜帶清晰且穩定，表明建立的伯樂樹ISSR反應體系是有效可靠的。

圖9 引物UBC823對23個伯樂樹個體擴增的ISSR帶型Figure 9 ISSR profiles generated by prime UBC823 from 23 samples

3 討論

能否得到高質量的DNA是成功進行分子標記分析的關鍵一步。伯樂樹分布僻遠，野外采樣時多使用硅膠干燥方法保存，同時由于其葉片含較多的多糖、多酚等成分，使得高質量DNA的獲得存在一定難度。實驗中采取一般的CTAB法提取，不僅抽提效率低，且多數樣品DNA溶液呈黃褐色，PCR時得不到擴增產物。因此，需在常規的CTAB法上作適當改進，首先在液氮研磨時須加入一定量的PVP粉末以抗氧化，且轉移要迅速，防止材料暴露過久；其次料液比要控制適當，1 m L提取液加40～50 mg樣本即可。

建立穩定的ISSR-PCR反應體系，一般可采用單因素或兩因素的完全試驗設計[19～20]，對各影響因素進行單因素多水平的比較研究，也可采用正交試驗設計[21～22]，以有效分析不同因素間的交互作用，但缺點是處理水平設置不宜過多。本實驗綜合了兩種試驗設計的優點，先對影響PCR結果的主要反應成分進行單因素多水平對比分析，確定各因素水平范圍后，再開展正交優化試驗，獲得了伯樂樹適宜的ISSR-PCR擴增體系：20μL體系中含90 ng模板DNA，1.0 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTP，0.5μmol/L引物，0.75U Taq DNA聚合酶。

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Establishment of ISSR-PCR Reaction System for Bretschneidera sinensis

XIE Zheng-cheng1，LOU Xiong-zhen2，YAO Li-wu1，HUANG Hua-hong2，LIN Er-pei2，LUO Wen-jian3，CHEN Chun-mei1
（1. Qianyuan Forestry Bureau of Zhejiang, Qianyuan 323800, China; 2. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 3. Zhejiang Forestry Seed and Seedling Administration, Hangzhou 310020, China）

The aim of this study was to establish and optim ize the amp lification system of ISSR-PCR forBretschneidera sinensis. 23 samples ofB. sinensisleaf were collected from Qingyuan of Zhejiang province for the test. The influencing factors of ISSR-PCR, such as DNA template, Taq DNA polymerase, M g2+, dNTPs, primer and annealing temperature were optim ized by test of single factor and orthogonal design. The results indicated that suitable ISSR-PCR system forB. sinensiswas established, namely 20 μL reaction system containing 90 ng template DNA, 1×PCR buffer, 1.0 mmol/L M g2+, 0.15mmol/L dNTPs, 0.5 μmol/L primers, 0.75U Taq DNA polymerase. The optimal annealing temperature was 50℃。

Bretschneidera sinensis; ISSR; marker system

S718.4

A

1001-3776（2011）01-0011-05

2010-07-06；

2010-11-17

浙江省重大科技專項“浙江省珍稀瀕危林木種質資源收集保存與利用關鍵技術研究及基因庫建設”（2006C12059-4）和浙江省科技重點項目“浙江省珍稀瀕危樹種現代保育關鍵技術研究”（2006C22064）

謝正成（1964－），男，浙江慶元人，高級工程師，主要從事森林培育研究；* 通訊作者。