宮頸病變中凋亡調控因子Bcl-2、Survivin及Fas的表達與意義

楊崢莉 趙 揚 劉榮霞 張 霞

河北省石家莊市第四醫院婦產科 050011

宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌的第二個常見的惡性腫瘤,其發病是多種因素作用導致多基因改變的結果。近年來發現腫瘤發生除與細胞過度增殖有關外,細胞凋亡的抑制也參與了宮頸癌的發生、發展。Bcl-2、Survivin、Fas是重要的細胞凋亡調節基因,它們不僅對維持細胞的正常生理功能與生存繁殖有著重要意義,而且在許多自身免疫性疾病及某些腫瘤的病理發生中具有重要作用。筆者應用免疫組織化學方法檢測Bcl-2、Survivin、Fas在正常宮頸、CIN、宮頸癌中的表達,揭示三者在宮頸癌的發展過程中的臨床意義,為宮頸癌的發生、發展的機制提供理論依據,為宮頸癌的預防和治療提供監測指標。

1 材料與方法

1.1 材料 所有標本為我院2000年1月-2007年4月間存檔石蠟標本共195份,其中正常子宮頸組織(來源于因子宮肌瘤或卵巢腫瘤行子宮全切的宮頸組織)30份,CINⅠ42份,CINⅡ38份,CINⅢ45份,宮頸浸潤鱗癌40份。患者術前均未接受化療、放療和性激素治療。年齡38～77歲,平均年齡52.6歲。

1.2 方法 所有標本均經10%甲醛固定,石蠟包埋,4μ m連續切片,HE染色,光鏡觀察。免疫組化采用SP法,鼠抗人Bcl-2單克隆抗體試劑盒、兔抗人Survivin多克隆抗體試劑盒、兔抗人Fas多克隆抗體試劑盒、SP(鼠/兔)免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。實驗步驟均按試劑盒說明書進行。光學顯微鏡下觀察,細胞漿和/或細胞膜呈棕黃色者為Bcl-2、Survivin、Fas陽性細胞。每例隨機計數200個細胞,計算其陽性細胞比率(%)記分:1～25為1分,26～50為2分,51～75為3分,76～100為4分;染色程度記分:淡黃為1分,棕黃為2分,棕褐為3分。評定結果:陽性細胞比率+染色程度總分數,陰性0～3分,陽性4～7分。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5軟件進行統計學處理,各樣本率差異的比較采用χ2檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Bcl-2、Survivin及Fas在正常宮頸上皮、CIN和宮頸癌中的表達情況 Bcl-2及Survivin陽性染色均主要定位于細胞漿,Fas表達陽性染色主要定位于腫瘤細胞胞質和胞膜中,呈淡黃色或棕黃色顆粒。正常宮頸上皮,Bcl-2、Fas有表達而Survivin無表達。Bcl-2、Survivin及Fas在CIN和宮頸癌中均有不同程度的表達,Bcl-2及Survivin在CIN中的陽性表達率顯著高于正常宮頸上皮(P＜0.05),在宮頸癌的陽性表達率顯著高于CIN組(P＜0.05)。而Fas在正常宮頸中的陽性表達高于CIN和宮頸癌組,差異均有統計學意義(P＜0.05);CIN與宮頸癌組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 Bcl-2、Survivin及Fas在CIN各期組織中的表達 在CIN組織中,隨著宮頸上皮內瘤樣病變的進展(CINⅠ～Ⅲ),Bcl-2表達陽性率分別為21.4%、31.6%和60.0%,CINⅠ、CINⅡ和 CINⅢ組間兩兩比較差異有統計學意義(P＜0.05);Survivin陽性率分別為23.8%、57.9%和86.7%,CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ組兩兩相比差異有統計學意義(P＜0.05);Fas表達陽性率,分別為 76.19%、44.70%和40.0%,CINⅠ分別與CINⅡ、CINⅢ組比較差異有統計學意義(P＜0.05),而CINⅡ與CINⅢ組間比較無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 Bc1-2、Survivin、Fas蛋白在正常宮頸、CIN及宮頸癌中的表達〔n(%)〕

2.3 Survivin與Bcl-2、Fas的相關性 經等級相關檢驗發現:在宮頸病變組織中,Survivin與Bcl-2的表達呈正相關(P＜0.05);Survivin與Fas的表達呈負相關(P＜0.05)。

3 討論

Bcl-2(B-celllymphoma/leukemia-2)為發現較早的凋亡抑制因子。Bcl-2基因定位在18q21,Bcl-2蛋白含239個氨基酸,分子量為26KD。轉基因試驗表明,Bcl-2基因有致癌性,其致癌機制并非通過促進細胞增殖引起,而是由于其抑制細胞凋亡造成腫瘤細胞的堆積[1]。可能的機制是通過封閉細胞核轉運,抑制細胞內鈣離子濃度升高,發揮抗氧化作用和抗凋亡作用。研究證實多種腫瘤組織中存在Bcl-2的過度表達[2～4],Bcl-2基因表達異常增加可使已有基因異常改變的細胞逃避凋亡,由此引起的基因異常事件的累積是導致細胞轉化和腫瘤形成的必要前提[5]。本研究采用免疫組化技術對正常宮頸、宮頸上皮內瘤變組織和宮頸癌組織中的Bcl-2蛋白表達進行檢測,發現Bcl-2蛋白在正常宮頸、CIN和宮頸癌組織中的陽性率逐漸增加,同時隨著CIN病變加重而逐漸升高,差異有統計學意義(P＜0.05)。提示Bcl-2蛋白過度表達與宮頸癌的發生有關,在宮頸癌變的早期階段,各種致癌因子如高危型HPV感染,引發細胞內Bcl-2基因活化,導致其基因產物的過度表達,Bcl-2通過抑制細胞凋亡,延長細胞壽命使遺傳物質突變率增加,從而增加腫瘤發生的機會。因此在臨床工作中,對Bcl-2陽性的患者一定要注意其病變的進展,給予適當的處理。

Survivin基因位于人類17號染色體q25區,屬于凋亡抑制蛋白家族(IAP),是IAP家族中迄今發現最強的凋亡抑制因子。具有抑制細胞凋亡和調節細胞有絲分裂的雙重功能,是聯系細胞周期和細胞凋亡界面的重要因子。在生理狀態下,凋亡途徑清除體內衰老和異常的細胞,有利于保持體內組織的動態平衡。在腫瘤發生的早期,Survivin過表達直接或間接抑制了凋亡,利于異常基因的進一步積聚,促使細胞惡性轉化,從而有助于腫瘤的進展。Branca等[6]研究表明Survivin是一種早期宮頸癌發生的標志,Survivin的抗凋亡功能是通過人乳頭狀瘤病毒(HPV)E6阻斷野生型P53的正常轉錄實現的。

Survivin是腫瘤特異性凋亡抑制因子,在幾乎人類所有的腫瘤中高表達[7]。Kim等[8]通過免疫組化的方法對41例CIN及宮頸浸潤癌的研究發現,隨著病變的發展,Survivin的表達逐漸升高。本研究結果在30例正常子宮頸組織中,Survivin表達均為陰性。在子宮頸上皮內瘤樣變中檢測到了Survivin的表達,而且隨子宮頸上皮內病變的進展,從正常子宮頸發展到CINⅠ、CINⅡ,再到CINⅢ,浸潤癌,Survivin的表達率逐漸升高,差異有統計學意義(P＜0.05),提示Survivin作為凋亡抑制蛋白在子宮頸從癌前病變到癌的演變進程中扮演了重要角色。Survivin在宮頸中的過度表達,通過抑制細胞凋亡,為存在基因缺陷的細胞提供生存優勢,促使基因突變的積聚和細胞惡性轉化,最終導致宮頸癌發生發展。因此,臨床上對于宮頸病理診斷CINⅠ～Ⅱ,同時Survivin表達陽性的病例,應嚴密隨訪并積極治療。

Fas是一種由319個氨基酸組成的分子量為45 000的Ⅰ型跨膜糖蛋白,在多種組織中均有表達,組織細胞類型不同表達程度也不同。Fas基因位于人染色體10q23上,Fas抗原屬于神經生長因子/腫瘤超家族的成員之一[9]。FasL是Fas抗原TNF家族,兩者結合可導致細胞調亡[10]。免疫研究發現,正常的Fas系統能有效地去除過度激活的免疫活性細胞,從而下調免疫反應及細胞毒性淋巴細胞的功能。如果Fas或其配體FasL出現表達異常,即可逃避機體免疫細胞的攻擊而不斷增殖,最終形成一個實體瘤[11]。Das等[12]觀察Fas在宮頸癌中的表達明顯下調。杜俊瑤等[13]研究顯示,Fas在正常宮頸、CIN及宮頸癌中表達差異有顯著性,隨腫瘤的形成有明顯降低的趨勢,并且與宮頸癌細胞的分化程度有關。本研究顯示,Fas在正常宮頸的陽性表達率86.67%,CIN的陽性表達率53.60%,而在宮頸癌中Fas表達率為45%。Fas在正常宮頸中表達顯著高于CIN及宮頸癌組(P＜0.05),CIN與宮頸癌組差異無顯著性(P＞0.05)。提示Fas的異常表達可能參與宮頸癌的發生、發展。宮頸癌細胞由于某種原因而降低了Fas的表達,細胞逃逸了機體的免疫監而難以凋亡,最終導致腫瘤的發生、發展和轉移。可見,Fas是免疫系統自穩的重要分子學基礎,增強Fas抗原表達及活化有望成為腫瘤治療新手段。

總之,宮頸癌的發生是多基因損傷的復雜過程,它的發生、發展與凋亡相關基因的異常表達、癌基因激活、抑癌基因的突變等有關。Bcl-2及Survivin在宮頸組織中的過表達及Fas的表達缺失而導致的細胞凋亡與宮頸癌的發生、發展有密切關系,對宮頸癌的診斷預后具有重要參考價值。

[1] Sanz L,Garcia-Marco JA,Casanova B,et al.Bcl-2 family genemodulation during spontaneous apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells〔 J〕 .Biochem Biophys Res Commun,2004,315(3):562-567.

[2] Konturek PC,Konturek CT,Sulekova Z,et al.Expression of hepatocyte growth factor,transforming growth factor alpha,apoptosis related proteins Bax and bcl-2,and gastrin in human gastric cancer〔J〕 .Alimeat Pharmacol Ther,2001,15(7):989.

[3] 康凱夫,陳堅平,黃金鳳,等.DNA-PKcs、Bcl-2、Cyclin G 在星形細胞瘤中的表達及與腫瘤分化和預后的關系〔J〕.實用癌癥雜志,2006,21(2):152.

[4] 黃金鳳,何志明,李煒霞,等.Bcl-2、Survivin在子宮內膜癌組織中的表達及意義〔J〕.實用癌癥雜志,2007,22(1):99.

[5] Manusirivithaya S,Siriaunkgul S,Khunamornpong S,et al.Association between bcl-2 expression and tumor recurrence in cerical cancer:A matched case-control study 〔J〕.Gynecol Oncology,2006,102(2):263-269.

[6] Branca M,Giorgi M,Santini D,et al.Survivin as a marker of cervical intraepithelial neoplasia and high-risk human papillomavirus and a predictor of virus clearance and prognosis in cervical cancer〔J〕.Am J Clin Pathol,2005,124(1):113-121.

[7] Takeuchi H,Morton DL,Elashoff D,et al.Survivin expression by metastatic melanoma predicts poor disease outcome in patients receiving adjuvant polyvalent vaccine〔J〕.Int J Cancer,2005,117(6):1032-1038.

[8] Kim HS,Shiraki K,Park SH.Expression of survivin in CIN and invasive squamous cell carcinoma of uterine cervix〔J〕.Anticancer Res,2002,22(2A)∶805-808.

[9] 桑威.Fas/FasL系統參與的幾種生物學效應〔J〕.國際免疫雜志,2006,11(9):389-392.

[10] Iwase M,Kondo G,Watanabe H,et al.Regulation of fas-mediated in neutrophils after surgery induced acute inflammation〔J〕.J Surg Res,2006,134(1):114-123.

[11] Zuo XL,Zhou Y,Li RF,et al.Relation of apoptosis of K562 cells induced by naringenin in vitro to enzyme activity changes of caspase-3 and caspase-8 and expression of FAS/FASL proteins〔J〕.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2008,16(2):286-289.

[12] Das H,Koizumi T,Sugimoto T,et al.Quantitation of Fas and Fas ligand gene expression in human ovarian,cervical and endometrial carcinomas using real-time quantitative RT-PCR〔J〕.Br J Cancer,2000,82(10):1682-1688.

[13] 杜俊瑤,姚嘉斐,辛彥.Survivin與 Fas在宮頸不典型增生和宮頸癌中的表達及臨床意義〔J〕.中國實用婦科與產科雜志,2005,21(11):672-674.