思密達治療潰瘍性結腸炎腹瀉的機制和療效

江學良，崔慧斐，任 晶

潰瘍性結腸炎 (ulcerativecolitis，UC)的發病機制仍未明確，目前認為UC的發病可能與腸道菌群失調、腸黏膜屏障功能缺陷、腸道通透性增高、腸道內成分誘發的異常免疫反應等因素有關［1］。其中，腸黏膜屏障損傷是導致UC腹瀉的重要原因，因此修復損傷的腸黏膜是治療UC腹瀉的關鍵措施之一［2］。

治療UC的主要藥物美沙拉嗪通過抑制炎癥間接減輕對腸黏膜屏障的損傷，而非直接修復損傷腸黏膜屏障。已有研究表明，思密達可有效修復慢性腹瀉患者腸道黏膜損傷［3］。本研究通過觀察思密達聯合美沙拉嗪治療前后UC大鼠模型腹瀉癥狀改善情況及腸黏膜通透性、腸黏膜形態的變化，以期闡明思密達治療UC腹瀉的機制。

1 材料與方法

1.1 動物 選取封閉群健康成年Wistar大鼠80只，雌雄各半，質量250～350 g。動物由山東大學動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 實驗動物適應性喂養標準飼料1周后，用二硝基氯苯 (DNCB)和乙酸 (AA)復合法造模［4－5］。大鼠頸背部用10%Na2S脫毛后，每天以20 g/L DNCB丙酮液滴背1次，0.3 ml/次，連續14 d。第15天用直徑3 mm的尼龍導管經肛門插入結腸8 cm處，注入0.04 mmol/L(0.1%)DNCB乙醇 (50%)液0.25 ml，第16天同部位注入80 ml/L AA溶液2 ml，準確定時15 s后再用5 ml 0.9%氯化鈉注射液沖洗。造模完成后1周觀察大便性狀、結腸大體形態及組織學 (光鏡和電鏡)改變，符合UC表現即造模成功。

1.2.2 實驗方法 造模成功后1周，將大鼠隨機分為兩組，每組40只。美沙拉嗪治療組 (對照組)大鼠喂服美沙拉嗪0.2 g·kg－1·d－1，8周。思密達聯合美沙拉嗪治療組 (聯合治療組)大鼠喂服美沙拉嗪0.2 g·kg－1·d－1，天然蒙脫石0.6 g·kg－1·d－1，8 周。

1.3 觀察指標 分別在治療前和治療8周后記錄腹瀉癥狀變化情況，測定腸道黏膜通透性，光鏡下觀察結腸組織學變化，電鏡下觀察腸黏膜超微結構包括微絨毛變化、組織緊密連接(TJs)、上皮細胞間隙 (dilated intercellular spaces，DIS)、腸基底膜細胞核分裂相和細胞凋亡情況。

(1)腸黏膜通透性測定采用尿中乳果糖與甘露醇的比率(L/M)，L/M值增大，說明腸黏膜通透性增高。(2)結腸炎癥程度分級按以下方法:0級，無多形核細胞;1級，固有層有少量多形核細胞浸潤;2級，固有層有明顯多形核細胞浸潤，累及50%以上隱窩;3級，有大量多形核細胞浸潤伴隱窩膿腫;4級，明顯急性炎癥伴潰瘍形成。(3)結腸組織學有效性評價:完全緩解，治療后病理分級比治療前下降，治療后病理分級0～1級;部分緩解，治療后病理分級比治療前下降，治療后病理分級＞1級;無變化，治療前后無變化。(4)結腸黏膜超微結構觀察:取腸黏膜組織各切成1 mm×1 mm×2 mm，迅速投入4℃的3%戊二醛－1.5%多聚甲醛－0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.2)，前固定2 h以上，經緩沖液漂洗后用1%鋨酸4℃后固定1.5 h，再漂洗后用系列乙醇、丙酮脫水，環氧樹脂618包埋。經半薄切片定位，超薄切片60 nm，用醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，置電鏡下觀察。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，計量資料以表示，采用t檢驗。等級資料采用Ridit分析，p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腹瀉癥狀改善情況 治療后，聯合治療組大鼠腹瀉癥狀恢復正常時間較對照組顯著縮短，差異有統計學意義 (p＜0.05，見表1)。

表1 兩組大鼠治療后腹瀉癥狀改善時間比較，d)Table 1 The comparsion of diarrhea recovery time of rats after treatment in two groups

表1 兩組大鼠治療后腹瀉癥狀改善時間比較，d)Table 1 The comparsion of diarrhea recovery time of rats after treatment in two groups

組別 例數 腹瀉次數恢復正常時間黏液膿血便40 15.8±3.2 16.6±3.7聯合治療組 40 9.9±4.8 11.6±6.2 t消失時間對照組9.15 6.19 P值值＜0.05 ＜0.05

2.2 腸黏膜通透性改變情況 治療前兩組大鼠尿中L/M值間差異無統計學意義 (P＞0.05);而治療后聯合治療組大鼠尿中L/M值較對照組顯著降低，差異有統計學意義 (p＜0.05，見表2)。

表2 思密達聯合美沙拉嗪治療UC大鼠尿中乳果糖與甘露醇的比率，%)Table 2 The ratio of lactulose admannitol in urine after treatment withSmecta and Mesalazine

表2 思密達聯合美沙拉嗪治療UC大鼠尿中乳果糖與甘露醇的比率，%)Table 2 The ratio of lactulose admannitol in urine after treatment withSmecta and Mesalazine

40 44.8±5.2 35.6±4.7聯合治療組 40 45.9±5.8 28.6±4.2 t組別 例數 治療前 治療后對照組1.26 9.93 P值值＞0.05 ＜0.05

2.3 大鼠組織學緩解情況 治療后對照組大鼠組織學完全緩解28例，部分緩解10例，無變化2例;聯合治療組完全緩解38例，部分緩解2例，無緩解0例。聯合治療組大鼠組織學緩解情況顯著好于對照組，差異有統計學意義 (u=8.22，p＜0.05)。

2.4 超微結構改變 UC大鼠結腸細胞超微結構受損嚴重，表現為微絨毛稀疏、紊亂、斷裂乃至脫落;線粒體腫脹，粗面內質網擴張，細胞核固縮;核染色體邊集明顯;可見清晰的凋亡小體，杯狀細胞明顯減少，殘留的杯狀細胞水腫明顯，線粒體腫脹、嵴突減少、嵴斷裂，內質網擴張。思密達聯合美沙拉嗪治療后4周，線粒體腫脹減輕，微絨毛和杯狀細胞恢復正常，凋亡細胞顯著減少;治療后6周，結腸上皮細胞微絨毛完整，細胞連接和細胞器未見損傷。而單純應用美沙拉嗪治療8周后，大鼠腸黏膜超微結構才完全恢復正常。聯合治療組和對照組大鼠結腸細胞超微結構恢復正常時間分別為 (35.8±6.2)d和 (52.0±8.7)d，兩組比較差異有統計學意義 (t=8.71，P ＜0.05)。

3 討論

腸黏膜屏障損傷是導致UC腹瀉的重要原因［6］。腸黏膜屏障是指正常腸道具有較為完善的功能隔離帶，可將腸腔與機體內環境分隔開來，防止致病性抗原 (腸腔內的細菌、有毒物質、食物抗原物質、致癌物質等)侵入的功能，使機體內環境保持相對穩定，維持機體的正常生命活動。腸黏膜屏障主要由機械屏障、生物屏障、化學屏障及免疫屏障組成。腸道機械屏障由腸黏膜表面的黏液層、腸上皮本身及其緊密連接、上皮基底膜、黏膜下固有層等組成。細胞連接是多細胞生物中細胞與細胞之間，細胞與細胞外基質之間的一些特化的連接裝置，是腸道機械屏障的重要組成部分，它們對機體的構建和功能都十分重要。腸上皮緊密連接一旦發生變異、減少或缺失，腸上皮細胞間隙通透性就會增加，細菌、內毒素及大分子物質可通過緊密連接進入體循環。UC的特征就是腸上皮細胞旁路通透性增高，允許腸腔內病原菌及其毒素通過并進入上皮下層，這是導致炎癥反復發作的重要原因［7］。檢測活動期UC腸黏膜組織，在中性粒細胞浸潤區域的與緊密連接相關的蛋白表達均明顯下降，非中性粒細胞浸潤的區域蛋白表達無明顯改變。蛋白表達降低，可能與活動期UC細胞側滲透性增加有關。UC有反復發作的腹瀉，腹瀉與腸道急性炎癥和慢性損害區域黏膜上皮細胞側膜滲透性增加有關。對UC結腸組織的研究表明，炎癥的結腸黏膜屏障功能減弱，緊密連接結構的改變是原因之一［8］。本研究發現，UC大鼠結腸細胞超微結構受損嚴重，表現為微絨毛稀疏、紊亂、斷裂乃至脫落;線粒體腫脹，粗面內質網擴張，細胞核固縮;核染色體邊集明顯;可見清晰的凋亡小體，杯狀細胞明顯減少，殘留的杯狀細胞水腫明顯，線粒體腫脹、嵴突減少、嵴斷裂，內質網擴張。提示腸黏膜屏障損傷是UC腹瀉重要原因。

如何修復損傷的腸黏膜是治療UC腹瀉的關鍵措施之一。現有治療UC的主要藥物，如美沙拉嗪通過非特異性抗炎作用，間接減輕炎癥對腸黏膜屏障損傷，但不能直接修復腸黏膜屏障。因此，聯合直接修復腸黏膜藥物有可能更迅速和長久緩解UC慢性腹瀉的癥狀。研究表明，思密達可以直接修復損傷腸黏膜［9］，因為思密達是由雙四面體氧化硅，單八面體氧化鋁組成的多層結構，其特殊結構具有相當大的表面積 (約100 m2/g)，對腸黏膜有很強的覆蓋能力，粘附于整個腸腔表面，具有極高的定位能力，對細菌、病毒及其毒素等攻擊因子具有強大的吸附作用，使其失去致病能力，并能覆蓋消化道黏膜與黏液蛋白結合，增強黏膜屏障，阻止病源微生物的攻擊，從而具有保護損傷的腸黏膜;思密達能抑制腸道致病菌的傳播，保護腸黏膜免受由致病菌感染引起的組織學變化，同時它能使腸黏膜凝膠增厚、黏液增多，并延緩黏液的生存時間，維護腸道正常分泌，減少水電解質流失，增強腸黏膜的屏障作用。因此，它能消除病原，起到止瀉的作用，且思密達不經腸道吸收入血，故安全無毒副作用。已經有多項研究表明，思密達對各種類型的腹瀉，包括成人與兒童、細菌感染與非細菌感染、急性與慢性腹瀉均有很好的療效，適用于多種類型的腹瀉［10－12］。

本研究發現，思密達聯合美沙拉嗪治療UC，較單純應用美沙拉嗪治療能更快修復損傷腸黏膜屏障，使線粒體腫脹減輕，微絨毛和杯狀細胞恢復正常，凋亡細胞顯著減少，細胞連接恢復正常，從而快速緩解腹瀉癥狀。另外，腸道對大分子物質的通透性試驗是評估腸道黏膜屏障功能的方法之一。腸道對大分子物質的通透性增加，意味著腸道結構有變化，腸屏障功能的損害，腸道內的細菌或毒素有可能通過腸道黏膜屏障進入血循環。因為甘露醇分子較小，可以通過絨毛細胞間緊密連接，主要反映絨毛細胞間緊密連接的通透性，而乳果糖分子直徑較大，主要通過腺管細胞間緊密連接被吸收，故主要反映腺管細胞間緊密連接的通透性，因此，二者聯合應用，測定尿中L/M值可間接但全面、準確地反映腸黏膜的通透性變化［13］。L/M值增大，說明UC腸通透性增高，腸屏障功能損害。思密達聯合美沙拉嗪治療后，L/M值顯著低于單純應用美沙拉嗪治療，表明思密加強了腸黏膜屏障功能。

總之，思密達聯合美沙拉嗪治療UC腹瀉，既可以通過美沙拉嗪抗炎作用減輕腸黏膜損傷，又可以通過思密達直接修復損傷腸黏膜，從而有望達到迅速長久止瀉的作用。由于UC患者腸黏膜屏障的各個環節都存在不同程度的損傷，將腸黏膜屏障修復作為治療UC新策略，將為UC治療提供新的思路［14－16］。

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