聯合檢測外周血癌胚抗原mRNA及livin mRNA對早期發現大腸癌微轉移腫瘤的意義研究

肖 維，彭 健，張陽德

大腸癌包括結腸癌和直腸癌，為臨床常見的惡性腫瘤，而且其發病率呈上升趨勢［1］。大腸癌血液微轉移腫瘤的早期發現與大腸癌的預后密切相關［2］，但是目前仍然缺乏高度特異性和靈敏性的早期診斷的實驗室檢查指標［3］。本研究通過反轉錄聚合酶鏈式擴增 (RT－PCR)法檢測大腸癌患者外周血液中癌胚抗原 (CEA)mRNA和livin mRNA的表達情況，探討二者對早期發現大腸癌血液微轉移腫瘤的意義，指導臨床對大腸癌的診療，對其預后做出客觀的判斷。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年2月—2010年3月就診于中南大學湘雅醫院肝膽腸外科的初發、初治大腸癌患者60例為研究對象，均經腸鏡或手術病理檢查證實;同時選取同時期30例大腸良性疾病 (息肉、腺瘤、腸炎、憩室等)患者為大腸良性疾病組和30例健康體檢正常者為對照組。大腸癌組男32例，女28例;年齡30～76歲，平均年齡 (56±3)歲;結腸癌25例，直腸癌35例;低中分化36例，高分化24例;Dukes A+B期31例，Dukes C+D期29例;有局部淋巴結轉移11例，無局部淋巴結轉移49例;有遠處轉移13例，無遠處轉移47例。大腸良性疾病組男17例，女13例;年齡22～73歲，平均年齡 (51±6)歲;息肉14例，腺瘤9例，腸炎5例，憩室2例。對照組男18例，女12例，年齡27～69歲，平均年齡 (49±7)歲。3組在性別及年齡方面具有均衡性。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol試劑 (GIBCO公司)，PCR引物、RT－PCR試劑盒由大連寶生生物公司合成和生產，電泳儀為北京六一公司產品，紫外分光光度儀、PCR儀為美國Thermo產品，凝膠成像系統為美國Bio－RAD公司產品。

1.3 方法

1.3.1 CEA、livin和內參GAPDH引物設計及合成 根據genebank提供的基因信息，利用引物設計軟件Primer 5.0自行設計引物，交由大連寶生生物公司合成，序列如表1所示。

表1 PCR引物序列及擴增長度Table 1 PCR primer sequences and amplification length

1.3.2 總RNA提取 患者入院第2天抽取肘靜脈血5 ml，采血管肝素鈉抗凝，去酶處理。采血后1 h內利用淋巴細胞分離液分離細胞，參照說明書使用Trizol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定其純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳實驗鑒定RNA的完整性。

1.3.3 RT－PCR法檢測CEA mRNA和livin mRNA的表達應用大連寶生生物公司生產的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0兩步法試劑盒進行RT及PCR，分別為10μl和40μl體系，按照試劑盒說明書步驟進行，RT反應條件:30℃×10 min，42℃ ×30 min，99℃ ×5 min，5℃ ×5 min，1個循環。PCR擴增反應條件:94℃ ×2 min，1個循環，再94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 30 s。共40個循環，延伸72℃ 5 min。最后所得產物在含0.45μg/ml溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠中電泳分離 (100 V，45 min)，紫外凝膠成像系統拍照觀察和分析結果。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，計數資料采用χ2檢驗，以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA完整性及純度鑒定結果 1%瓊脂糖凝膠電泳實驗顯示所有RNA皆有5 S、18 S和28 S3條帶，28 S條帶亮度最高 (見圖1)，證實RNA完整性良好。紫外分光光度計測得所有樣本RNA的A 260/A 280處于1.8～2.0，證明RNA純度較高，排除蛋白質及DNA污染。

2.2 大腸癌組、大腸良性疾病組和對照組CEA mRNA和livin mRNA的表達情況 60例大腸癌患者中CEA mRNA陽性表達率為58.3%(35/60)，livin mRNA陽性表達率為61.6%(37/60)。大腸良性疾病組和對照組中CEA mRNA和livin mRNA均無陽性表達。3組CEA mRNA和livin mRNA陽性表達率比較，差異均有統計學意義 (p＜0.05)。CEA mRNA和livin mRNA的RT－PCR擴增見圖2。

圖1 大腸癌組、大腸良性疾病組和對照組RNA電泳圖Figure 1 RNA electrophoresis figure of colorectal cancer group，benign disease group and control group

圖2 CEA mRNA和livin mRNA的RT－PCR擴增圖Figure 2 RT－PCR figure of CEA mRNA and livin mRNA

2.3 大腸癌組患者CEA mRNA和livin mRNA的表達與臨床特征的關系 大腸癌患者外周血中CEA mRNA和livin mRNA的表達與性別、年齡、腫瘤分化程度及腫瘤部位無明顯相關性(P＞0.05);而與腫瘤的臨床分期、有無淋巴結和遠處轉移有關 (p＜0.05，見表2)。即腫瘤臨床分期越晚，出現淋巴結和遠處轉移，CEA mRNA和livin mRNA的陽性表達率越高。

2.4 CEA mRNA和livin mRNA聯合檢測與單一檢測陽性率比較 大腸癌患者CEA mRNA和livin mRNA雙陽性20例，CEA mRNA陽性而livin mRNA陰性15例，CEA mRNA陰性而livin mRNA陽性17例。CEA mRNA和livin mRNA聯合檢測陽性率為86.7%(52/60)，與CEA mRNA單項陽性率58.3%(35/60)及livin mRNA單項陽性率61.6%(37/60)比較，差異均有統計學意義 (χ2值分別為12.079和9.786，p＜0.05)。

表2 大腸癌組患者CEA mRNA和livin mRNA的表達與臨床特征的關系Table 2 Relationship between CEA and livin mRNA expression and clinical features in colonrectal cancer patient

3 討論

大腸癌為臨床常見腫瘤，目前主要治療手段包括手術治療、化療、放射治療等。研究表明，大腸癌5年生存率約為50%，即使臨床病變較早期的病理檢測淋巴結陰性的患者，5年內仍有20% ～30% 死于轉移或復發［4］。大腸癌的復發與轉移很大程度上與腫瘤微轉移有關［5］。分析其原因有:(1)大腸癌早期發病沒有癥狀或者癥狀輕微，容易導致患者的忽視，常規檢查不能較早的檢測出處于早期或者隱匿期的大腸癌。然而早期腫瘤已經存在微轉移腫瘤［6］。(2)已經確診為大腸癌的患者，即使接受了正規的手術或者放化療治療，可能在治療之前就已經存在了微腫瘤的局部或者遠處的血道轉移，而這些微轉移灶是常規病理細胞形態學和免疫組織化學檢查還不能發現的［3］。

CEA是一種特異性較高的腫瘤相關抗原，大約95%大腸癌有CEA基因的表達，CEA在小細胞肺癌、乳腺癌等中也有表達。目前，CEA mRNA被廣泛用于大腸癌微轉移檢測。Wang等［7］研究發現大腸癌患者外周血CEA mRNA的陽性表達率為72.2%，特異性為100.0%，其陽性表達率可獨立預測術后轉移，與腫瘤侵潤深度、血管侵犯和TNM分期顯著相關。Sadahiro等［8］通過長期隨訪研究發現，大腸癌根治術后7～10 d外周血CEA mRNA仍然陽性患者其術后復發率明顯增高，無病生存 (DFS)和總生存 (OS)明顯差于CEA mRNA陰性患者。朱元祺等［9］研究發現結腸癌患者外周血中CEA mRNA陽性表達率為45.0%，在健康人體內無表達，CEA mRNA陽性表達率與腫瘤分期相關。

細胞的凋亡受抗凋亡蛋白如Bcl－2家族和凋亡抑制蛋白(IAP)家族的調控［10］。livin是IAP家族中新近發現的一種凋亡蛋白，可以通過抗死亡受體途徑、抗線粒體途徑和激活JNKl信號轉導等途徑發揮抑制細胞凋亡和抵抗腫瘤放化療作用［11］。livin在成人的正常組織中幾乎不表達，而在腫瘤組織表達明顯上調［12］。許多 livin基因表達與腫瘤的研究顯示，livin基因顯著表達于膀胱癌、小細胞肺癌、肝癌、大腸癌等惡性腫瘤，且其表達水平的高低與腫瘤的惡性程度、轉移及預后情況相關［13－14］。

本研究利用RT－PCR技術檢測CEA mRNA和livin mRNA的表達，結果顯示，CEA mRNA和livin mRNA在大腸良性疾病患者和健康者外周血中均無表達，而在大腸癌患者中陽性表達率分別為58.3%(35/60)和61.6%(37/60)。CEA mRNA和livin mRNA的表達均與患者性別、年齡、腫瘤分化程度及腫瘤部位無明顯相關性，而隨著腫瘤的Dukes臨床分期越晚，出現局部和遠處轉移，CEA mRNA和livin mRNA表達增高。由此推測，CEA和livin可能與腫瘤的轉移和復發有關，外周血中CEA mRNA和livin mRNA的檢測有助于發現早期血道微轉移，其在外周血中的表達可能是大腸癌惡化發生復發轉移所伴隨的分子生物學變化。因此，通過檢測大腸癌CEA mRNA和livin mRNA的表達有助于大腸癌的早期診斷及微轉移灶的發現。

Xu等［15］采用實時熒光定量RT－PCR技術檢測大腸癌患者外周血CK20 mRNA、CK19 mRNA、CEA mRNA的表達水平，發現即使在早期腫瘤患者的外周血中都有較高的陽性率，同時聯合檢測2個或3個指標時，可以極大地提高陽性檢出率，對于檢測早期大腸癌血液循環中的腫瘤細胞有意義。本研究結果顯示，單獨檢測CEA mRNA或livin mRNA，陽性檢測率分別為58.3%和61.6%。而聯合檢測陽性檢出率提高到86.7%。因此，聯合檢測CEA mRNA和livin mRNA的表達對于大腸癌早期診斷和血液中微轉移腫瘤的發現具有重要意義，進而可以預測大腸癌患者預后。同時，由于CEA mRNA和livin mRNA的表達與腫瘤的分期有關，表達陽性可以提示血液微腫瘤的存在，可以動態觀察大腸癌患者血液中CEA mRNA和livin mRNA的表達，有助于指導臨床治療。

總之，利用RT－PCR技術檢測外周血中CEA mRNA和livin mRNA的表達能夠早期診斷大腸癌和早期發現微轉移腫瘤，進而指導臨床治療，判斷預后。

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