銀杏外種皮多糖對人宮頸癌細胞系Siha增殖及侵襲的影響

楊 濱，婁曉明，吳春麗，李婉萍

銀杏(Ginkgo biloba L.)是木本孑遺植物，其葉、果和外種皮皆可入藥。銀杏外種皮是銀杏種子的外皮層，包含有大量的銀杏多糖、銀杏內酯、黃酮及被稱作銀杏酚、酸的化合物等多種物質。有報道表明，銀杏外種皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides，GBEP)對胃癌、肺癌及肝癌細胞的生長具有一定的抑制效果［1-3］，但其在宮頸癌方面的研究較少。本文研究體外銀杏外種皮對人宮頸癌細胞增殖及遷移的影響，探討其對宮頸癌的治療作用。

1 實驗材料

1.1 細胞株及培養方法 細胞株:Siha細胞株購自中科院，由本實驗室傳代保存。細胞培養:用含有10%小牛血清的高糖RPMI1640培養基，37℃飽和濕度、5%CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長，每2～3天傳代1次。

1.2 實驗儀器及試劑 酶標儀(BIOTEKElx800);AE30/31倒置相差顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司);HF90 CO2細胞培養箱(上海力申科學儀器有限公司)。細胞培養用試劑購自Hyclone公司，RNA prep pure動物組織總RNA提取試劑盒，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒，2×Taq Real Master Mix(SYBR Green)購自天根生物科技(北京)有限公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，抗體購自Abcam公司，噻唑藍(MTT)購自Sigma公司，ELISA檢測試劑盒購自RB公司，其他試劑為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 銀杏外種皮粗多糖的制備 稱取適量銀杏外種皮，置于圓底燒瓶中，按料液比1∶10、沸水浸提1 h，在熱水浴中回流浸提3次，冷卻后過濾，合并上清液。上清液經減壓濃縮，三氯乙酸脫蛋白，離心，調pH至中性，加入一定體積的95%乙醇，使終濃度為80%。充分攪動，靜置沉淀，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，真空干燥即可得粗多糖。經計算，得到外種皮原料中多糖含量為6.684 g/100 g。

2.2 MTT法檢測GBEP對Siha細胞的增殖影響

將GBEP用PBS溶出，調pH至中性，過濾除菌，于4℃冰箱中保存備用，GBEP稀釋為 10、20、40、80、160、320 μg/mL 濃度梯度。取對數生長期細胞，調節細胞濃度為5×104個/mL，將細胞以每孔200 μL接種于96孔培養板，培養12 h，使其充分貼壁，然后換為無血清的RPMI-1640培養，加入含GBEP的無血清RPMI-1640培養液培養，每個濃度設3個復孔。對照組為不含GBEP的RPMI-1640 培養基，5%CO2，37 ℃ 中孵育 24、48、72 h。每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續放入CO2培養箱中染色4 h，吸去上清，加入200 μL DMSO溶解細胞內形成的結晶，用酶標儀測定490 nm處吸光度(OD)值，計算GBEP對Siha細胞生長的抑制率。抑制率(%)=(空白孔OD值－實驗孔OD值)/空白孔OD值×100%，同時計算IC50值，并確定合適的3個實驗計量和實驗時間，用于后續實驗。

2.3 檢測GBEP對Siha細胞的侵襲抑制作用應用鋪有Matrigel的Transwell小室法測定GBEP對Siha細胞遷移情況的影響，將鋪膠后的Transwell小室放入24孔板中，下室加入含10%FBS的 RPMI-1640培養液 500 μL;在上室加入含GBEP 終濃度為 0、10、20、40、80、160、320 μg/mL的100 μL細胞懸液，細胞數為1×105個/孔。常規培養24、48、72 h，取出 Transwell小室，PBS 輕輕沖洗，擦去微孔膜上層的細胞，甲醛室溫下固定15 min，蘇木素染液染色，倒置顯微鏡下(×400)對遷移至微孔膜下層的細胞計數。每個樣本選取5個視野計數細胞，取其均數。遷移率(%)=實驗孔細胞數/空白孔細胞數×100%。

2.4 Siha細胞中人基質金屬蛋白酶2(MMP-2)基因Real Time PCR檢測 經MTT實驗確定的實驗條件，取不同濃度(0～320 μg/mL)GBEP處理下對數生長期的Siha細胞，加入裂解液收集，提取RNA，并測得濃度，逆轉錄后，進行Real Time PCR檢測，以GAPDH作為內參，進行相對表達量分析。MMP2基因引物為:Forward primer:TGGTTTTCCTCCATCCAGTGG，Reverseprimer:CAGGTTGTCTGAAGTCACTGC。

2.5 GBFP對Siha細胞MMP-2蛋白分泌表達的影響 經MTT實驗確定的實驗條件，收集不同濃度GBEP處理下的 Siha細胞培養液上清，4 000 rpm離心10 min，取上清，用MMP-2 ELISA測定試劑盒檢測腫瘤細胞上清中MMP-2含量。

2.6 統計方法 實驗數據應用SPSS 13.0統計軟件包進行統計分析，各指標用均數±標準差表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 MTT法檢測GBEP對Siha細胞增殖的影響

MTT檢測正常Siha細胞與GBEP處理后的Siha細胞在處理后24、48、72 h后的增殖情況，并繪制生長曲線，見表1、圖1。結果顯示，GBEP處理后的細胞較正常培養的Siha細胞增殖速度明顯減緩，經計算，得到 24 h、48 h、72 h的 IC50值分別為78.09、58.25 和48.63 μg/mL，48 h 為適合實驗。

表1 不同濃度及時間GBEP對Siha細胞增殖的抑制情況

圖1 GBEP對Siha細胞的增殖抑制曲線

3.2 GBEP對Siha細胞侵襲的影響 利用Transwell細胞培養小室測定GBEP處理后細胞遷移能力的變化，見圖2。結果顯示，GBEP處理后，Siha細胞遷移細胞數明顯低于正常培養細胞(P＜0.05);隨著GBEP濃度的增加，細胞遷移率逐漸降低，隨著藥物處理時間的增加，細胞遷移率降低。

圖2 GBEP對Siha細胞遷移的影響

3.3 Real Time PCR檢測Siha細胞中MMP-2基因表達情況 應用Real Time PCR方法檢測未經處理Siha細胞和GBFP處理后的細胞中MMP-2基因的表達情況，結果如圖3所示，隨著GBFP濃度的增加，Siha細胞中MMP-2基因的表達量降低，濃度為40 μg/mL時，差異有統計學意義(P＜0.05)，80 μg/mL以上時，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。

圖3 不同濃度GBEP對siha細胞中MMP-2基因表達的影響

3.4 GBEP對Siha細胞上清中MMP-2分泌表達的影響 見圖4。結果顯示，GBFP可明顯降低Siha細胞上清中MMP-2的分泌表達，80 μg/mL以上GBFP處理組與對照組相比，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。

圖4 不同濃度GBEP對siha細胞MMP-2分泌表達的影響

4 討論

多糖作為一種重要的生物活性成分，不是一種單一的化學物質，而是聚合程度不同的多種糖物質的混合物［4］。多糖具有提高免疫、抑制腫瘤等多方面功能，在植物、動物、微生物中廣泛存在，近年來多糖成為天然藥物的一個研究熱點。銀杏外種皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides，GBEP)是從銀杏的外種皮中提得的活性多糖物質［5］。由于銀杏外種皮是銀杏加工過程產生的廢棄物，不僅污染環境，也造成資源浪費，而從其中提取多糖，原料成本低，變廢為寶，具有廣闊的應用前景。

在惡性腫瘤的發生發展過程中，增殖和遷移是其主要特性，是惡性腫瘤預后不良及導致死亡的主要原因之一，因此，通過藥物抑制腫瘤細胞的遷移和增殖，是癌癥治療的手段之一［6-7］。

宮頸癌在女性惡性腫瘤中位居首位，本文用MTT法觀察GBEP對宮頸癌細胞株Siha增殖的抑制作用。結果表明，GBEP對Siha細胞的增殖具有抑制作用，在10～320 μg/mL劑量下，體外作用24～72 h，GBEP對 Siha細胞體外增殖的抑制率隨劑量增加和時間延長而增加，具有劑量依賴性和時間依賴性，這與GBEP對其他癌細胞的研究結果相符，在GBEP對胃癌細胞及肝癌細胞的研究中有相似性。

在對細胞遷移作用的研究中，銀杏外種皮多糖對宮頸癌細胞的遷移，同樣起到了抑制作用，當GBEP劑量為40 μg/mL，與對照細胞相比，差異有統計學意義(P ＜0.05)，80 μg/mL以上時，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，表明GBFP對Siha細胞的遷移具有抑制作用。同時，應用Real Time PCR方法檢測了與細胞遷移相關的MMP-2基因，基質金屬蛋白酶(Matrix Metallo proteinases，MMPs)是鋅肽酶，是一種能降解細胞外基質的蛋白水解酶，MMPs的表達和活化與腫瘤的生長、侵襲和轉移密切相關，在惡性腫瘤中MMPs經常過度表達［8］，其對腫瘤的侵蝕、轉移有非常重要的作用。因此，MMPs被認為是癌癥患者的預后因子和治療靶點。Real Time PCR檢測結果表明，隨著GBEP濃度的增加，Siha細胞MMP-2表達量降低，這個結果也與 ELISA檢測結果相同，共同證明GBEP對宮頸癌細胞Siha細胞遷移的抑制作用。

綜上所述，銀杏外種皮多糖對宮頸癌細胞Siha細胞的生長增殖和遷移侵襲具有抑制作用，在分子水平初步證明其具有抑制Siha細胞遷移相關基因的表達，為GBEP應用于宮頸癌治療的可能性提供依據。

［1］ 許愛華，陳華圣.銀杏外種皮多糖對人癌細胞系的抑制作用及與阿霉素的協同效應［J］.中國新藥雜志，2000，9(11):753-755.

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［4］ Itokawa H，Totsuka N，Nakahara K，et al.Antitumor principles from Ginkgo bilobaL［J］.Chem Pharm Bull，1987，35(7):3016.

［5］ Ji Su KL，You Sun C，Eun JungP，et al.Phospholipase C1 inhibitory principles from the sarcotestas of Ginkgo biloba［J］.J Nat Prod，1998，61:867.

［6］ 鄭小冬，呂杰強，朱雪瓊，等.抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽對宮頸癌Siha細胞增殖和凋亡的影響［J］.實用醫學雜志，2009，25(22):3743-3746.

［7］ 錢德英，歐陽云雁，趙楊，等.RNAi干擾HPV16E6基因對宮頸癌 Siha細胞的影響［J］.實用醫學雜志，2010，26(9):1505-1507.

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