坎地沙坦抑制小鼠視網膜新生血管的實驗研究

李 迅，王嘉俊，劉鶴南，陳曉隆

在增殖性視網膜病變的發生、發展過程中，腎素-血管緊張素系統中主要效應介質AngⅡ可能與特異性生長因子(特別是VEGF)相互作用來影響視網膜的發育和功能，最終共同導致視網膜新生血管形成［1］。因此，抑制AngⅡ可能會成為預防和治療視網膜新生血管的臨床方法。本實驗探討RNV發生發展過程中，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑坎地沙坦抑制RNV的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 (1)實驗動物:鼠齡為7 d的健康C57BL/6J清潔級新生小鼠(中國醫科大學動物部)40只，體質量4.0～5.0 g，性別不限，與哺乳母鼠共同飼養，所有動物均具有動物檢疫合格證，無任何眼疾。實驗動物及實驗條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》。(2)藥品試劑:坎地沙坦、BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)、ECL發光試劑盒(美國Pierce公司)、異硫氰酸葡聚糖熒光素(美國Sigma公司)、兔抗小鼠AngⅡ多克隆抗體(美國Sigma公司)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗體(美國 Sigma公司)、羊抗兔IgG-HRP(美國Sigma公司)。

1.2 方法 (1)動物分組和模型建立:將40只7 d齡C57BL/6J清潔級新生小鼠隨機分為2組:高氧組和坎地沙坦組，每組20只。參照 Smith等［2］的方法建立氧誘導視網膜病變模型，高氧組和坎地沙坦組小鼠及哺乳母鼠置于密閉氧箱中，控制氧濃度為(75% ±2%)，5 d(鼠齡12 d)后回到正?？諝猸h境中。小鼠出氧箱后，坎地沙坦組和高氧組每日分別腹腔注射纈沙坦40 mg/kg和等量生理鹽水，連續5 d。所有動物保持溫度(21±1)℃，光照-黑暗循環/12 h。熒光素血管灌注視網膜鋪片:兩組鼠齡17 d的小鼠各取3只，將異硫氰酸葡聚糖熒光素溶于1 mL的4%多聚甲醛中，經左心室灌注(0.03 mL/g)，摘取眼球，于4%多聚甲醛中固定1 h，游離視網膜，以視盤為中心呈放射狀對稱切開，用抗熒光衰退封片劑將視網膜封片，采用熒光顯微鏡(日本Olympus公司)觀察視網膜血管形態的變化。突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核計數:兩組鼠齡17 d的小鼠各取5只，摘除眼球后，于4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，平行于角膜至視盤的矢狀位連續4 μm切片，蘇木素-伊紅染色。每只眼球取10張切片，每組50張，由同一操作者采用隨機、盲法在光學顯微鏡(日本Olympus公司)下對切片樣本計數每張切片突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數。選取切片時，注意避開視盤周圍，計數血管內皮細胞核時，僅計數與內界膜有緊密聯系的細胞核，不包括玻璃體腔內其他與內界膜無聯系的血管內皮細胞核。Western blot檢測AngⅡ及VEGF蛋白表達:兩組鼠齡17 d的小鼠各取12只，提取視網膜組織蛋白質，用BCA蛋白定量試劑盒定量視網膜組織蛋白質含量，每個樣品上樣含量30 μg，以10%SDS-PAGE 電泳(4 ℃，120 V，2 h)分離蛋白質，電轉移法將蛋白質轉移至硝酸纖維素濾膜上，用4%脫脂奶粉，于4℃下過夜封閉硝酸纖維素濾膜的非特異性蛋白質結合位點，將濾膜于兔抗小鼠AngⅡ多克隆抗體(1∶400)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗體(1∶400)在37℃下孵育2 h，TBS-T緩沖液沖洗濾膜3次后，將濾膜轉移至二抗羊抗小鼠 IgG-HRP(1∶1 000)，37℃下孵育1 h，TBS-T緩沖液再次沖洗濾膜后，ECL化學發光顯影。采用 β-actin(1∶400)作為內參照。應用Quantity One 4.2軟件分析，分別比較各組AngⅡ、VEGF條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，表示各組蛋白相對表達水平。

1.3 統計學分析 所有數據應用SPSS 16.0進行統計學分析，結果以±s表示，計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，兩變量間相關性采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光素血管灌注視網膜鋪片 高氧組視盤周圍可見大片無灌注區，視網膜血管不規則擴張，走行迂曲，無灌注區周圍可見大量新生血管叢，伴明顯熒光滲漏;坎地沙坦組與高氧組比較，血管迂曲和不規則擴張減輕，新生血管叢減少，熒光滲漏減輕。

2.2 突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數高氧組可見較多突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核，有些單獨出現，有些成簇出現;坎地沙坦組與高氧組比較，平均每張切片中突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數減少，差異有統計學意義(P ＜0.05，見圖1)。

圖1 突破視網膜內界膜血管內皮細胞核比較

2.3 視網膜AngⅡ和VEGF蛋白表達的變化Western blot檢測發現，兩組視網膜均有AngⅡ蛋白表達，AngⅡ蛋白在坎地沙坦組視網膜中表達較高氧組顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.01，見表1);Western blot檢測發現，兩組視網膜中均有VEGF蛋白表達，VEGF蛋白在坎地沙坦組視網膜中表達較高氧組顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.01，見表1)。經Pearson相關分析，在氧誘導視網膜病變中，AngⅡ和VEGF蛋白的表達呈明顯正相關(r=0.77，P ＜0.01)。

表1 視網膜AngⅡ和VEGF蛋白相對含量的比較(±s)

表1 視網膜AngⅡ和VEGF蛋白相對含量的比較(±s)

灰色標度比值高氧組 坎地沙坦組P AngⅡ 0.377±0.005 0.169±0.0040.01 VEGF 0.369±0.004 0.188±0.006

3 討論

本研究利用氧誘導視網膜病變模型，目的在于探討坎地沙坦對RNV的抑制作用。結果表明，AngⅡ通過上調VEGF參與增殖性視網膜病變中RNV的形成，早期應用坎地沙坦均可一定程度抑制RNV形成。

本文研究顯示，在視網膜新生血管發生發展過程中，AngⅡ和VEGF蛋白水平升高，且兩者呈正相關。AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統的主要成分和效應分子，由血管緊張素I在血管緊張素轉換酶和絲氨酸蛋白酶的作用下轉化生成，通過AngⅡ受體發揮作用［3］。事實上，AngⅡ的絕大多數生物學效應包括:血壓調節、細胞生長、血管生成和生長因子誘導等，均通過AngⅡ受體介導，因此，AngⅡ不僅是一種血管活性物質，而且還是一種生長因子，可以促進多種血管細胞的擴散、轉移以及合成，從而引起血管生成和重建［3-4］。AngⅡ受體是一種七跨膜結構域G蛋白偶聯受體，并通過以下3種途徑發揮作用:①AngⅡ受體和異三聚體G蛋白相互作用，激發不同的信號級聯反應，包括磷脂酶C、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白激酶C和絲裂原活化蛋白激酶的激活。②AngⅡ通過AngⅡ受體激活許多非受體酪氨酸激酶類的磷酸化作用，包括磷脂酶cγ、Src家族蛋白激酶、Janus激酶、粘著斑激酶、富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶。③AngⅡ對某些酪氨酸激酶受體也具有反式激活［5］。VEGF是一種有效的促血管生成的活性因子，在增殖性視網膜病變中，VEGF表達上調并參與血-視網膜屏障的破壞［6］。在視網膜周細胞和血管內皮細胞中，AngⅡ通過血管緊張素Ⅱ受體介導VEGF表達，刺激VEGF產生，影響視網膜微血管系統的發育［7］。坎地沙坦通過選擇性阻斷血管緊張素Ⅱ受體和AngⅡ結合發揮拮抗作用。

本文實驗結果表明，坎地沙坦減少AngⅡ生成，從而抑制VEGF，短期內對以RNV為特征的增殖性視網膜病變的防治和轉歸有重要意義。但長期療效還需進一步的實驗和臨床研究來證實。

［1］ 劉鶴南，朱穎，陳曉隆，等.腎素-血管緊張素系統阻滯劑預防早產兒視網膜病變研究［J］.中華眼底病雜志，2010，28(3):291-293.

［2］ Smith LE，Wesolowski E，McLellan A，et al.Oxygen-induced retinopathy in the mouse［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35(1):101-111.

［3］ Suzuki Y，Ruiz-Ortega M，Lorenzo O，et al.Inflammation and angiotensin Ⅱ［J］.Int J Biochem Cell Biol，2003，35(6):881-900.

［4］ Nouet S，Nahmias C.Signal traneduction from the angiotensinⅡ AT2 receptor［J］.Trends Endocrinol Metab，2000，11(1):l-6.

［5］ Yin G，Yan C，Berk BC.Angiotensin Ⅱ signaling pathways mediated by tyrosine kinases［J］.Int J Biochem Cell Biol，2003，35:780-783.

［6］ Wang X，Wang G，Wang Y.Intravitreous vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor 1a in patients with proliferative diabetic retinopathy［J］.Am J Ophthalmol，2009，148(6):883-889.

［7］ Tee LB，Penrose MA，O＇Shea JE，et al.VEGF-induced choroidal damage in a murine model of retinal neovascularisation［J］.Br J Ophthalmol，2008，92(6):832-838.