激素聯(lián)合丙種球蛋白治療多發(fā)性硬化的臨床研究

孟慶萍，王嘉俊，馮 娟*，焦彥嶺，潘 月

多發(fā)性硬化(MS)是一種炎性反應(yīng)性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘損害為主［1-3］，主要臨床特點(diǎn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)散在分布的多病灶與病程中呈現(xiàn)的緩解復(fù)發(fā)，癥狀和體征的空間多發(fā)性和病程的時(shí)間多發(fā)性［4］。其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。有研究顯示，MS患者免疫調(diào)節(jié)機(jī)制存在異常，免疫球蛋白可通過非特異性的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能［5］。本研究采用激素聯(lián)用丙種球蛋白治療MS患者，取得了良好的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 一般資料 41例均為遼寧省內(nèi)各醫(yī)院2006年2月-2010年12月門診與住院患者，臨床診斷均符合McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)臨床表現(xiàn)、體征以及影像學(xué)檢查和電生理檢查，確定:①中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)內(nèi)有2處或2處以上的病灶;②病程中有2次或2次以上的緩解復(fù)發(fā)史，其間歇期在1個月以上，每次復(fù)發(fā)持續(xù)時(shí)間在24 h以上;③研究前基礎(chǔ)EDSS評分在0～4.5之間;④發(fā)病年齡為17～60歲;⑤排除標(biāo)準(zhǔn):臨床孤立綜合征(CIS);進(jìn)行性的MS;在研究過程中伴有臨床復(fù)發(fā)的MS患者。將病例隨機(jī)分成2組。聯(lián)合治療組20例，男9例，女11例，年齡17～59歲，平均年齡36歲;對照組21例，男10例，女11例，年齡18～60歲，平均年齡35歲。

1.2 研究方法

1.2.1 給藥方法 兩組患者均接受激素治療，急性活動期用甲基強(qiáng)的松龍1 g/d加入500 mL生理鹽水中靜脈滴注，連用3 d后，減量至500 mg/d加入500 mL生理鹽水中靜脈滴注，連用3 d后，減量至250 mg/d加入250 mL生理鹽水中靜脈滴注，再連用3 d后，減量至120 mg/d加入250 mL生理鹽水中靜脈滴注，繼續(xù)連用3 d，然后改為口服潑尼松60 mg/d，4～6周逐漸減量至停藥。同時(shí)應(yīng)用胃黏膜保護(hù)劑。聯(lián)合治療組加用丙種球蛋白0.4 g/kg靜脈注射，每日1次，連續(xù)治療5 d。所有患者在治療前和開始治療后的3周，均檢測臨床及免疫學(xué)的變量。

1.2.2 神經(jīng)學(xué)評估 參照Kurtzke神經(jīng)功能障礙量表(EDSS)［6］，兩組患者治療前和開始治療后的3周分別應(yīng)用EDSS量表評估1次。

1.2.3 免疫方面的檢測 外周血單核細(xì)胞(PBMC)通過Ficoll-Isopaque進(jìn)行分離，血樣被1∶1稀釋在RPMI 1640培養(yǎng)基中(其中包含有5 mM HEPES，100 U/mL的盤尼西林，100 g/mL的鏈霉素)。稀釋后密度梯度離心法分離PBMC，然后在含有10%的熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI中進(jìn)行洗滌。通過臺盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)存活細(xì)胞的數(shù)量。這些細(xì)胞在加有10%的FBS的RPMI中進(jìn)行再懸浮，然后用于細(xì)胞因子的測定和分析。

1.2.4 外周血單核細(xì)胞的增殖 PBMC(外周血單核細(xì)胞)的增殖是通過MTT分析方法進(jìn)行的。3×103個 PBMC，在200 μL同時(shí)加有 10%FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基中，用1 μg/mL的聚羥基脂肪酸酯(PHA)進(jìn)行處理，接種于96孔培養(yǎng)板(200 μL/孔)。平板在5%CO2、溫度為37℃條件下孵育 72 h，加入 20 μL 的 5 mg/mL MTT，孵育 4 h。離心后，棄去中層物質(zhì)，每孔加200 μL二甲基亞砜(DMSO)。在540 nm處分別讀取刺激和非刺激組細(xì)胞的光密度(OD)值。通過MTT比色法檢測細(xì)胞增殖，用“平均刺激指數(shù)(SI)”表示，SI=OD(刺激組細(xì)胞)/OD(非刺激組細(xì)胞)。

1.2.5 細(xì)胞因子的分析 密度為2×106/mL的PBMC(外周單核細(xì)胞)在1 mL伴有和不伴有PHA(1 μg/mL)的培養(yǎng)基中各孵育1次，然后在細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h，收集上清液，采用ELISA方法定量分析IFN-γ、IL-10的水平。每個樣本分為2份，利用全自動定量繪圖酶標(biāo)儀測定405 nm和650 nm下吸光度。IFN-γ、IL-10的敏感度分別為2、4.1 pg/mL。兩組于治療前開始、治療后3周均取肘靜脈血3 mL，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-6的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)通過中位數(shù)的百分比(95%的可信區(qū)間)表示。計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用±s表示，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05;Mann-Whitney檢驗(yàn)用于兩組的中位數(shù)的比較，Wilcoxon檢驗(yàn)用于連續(xù)變量的分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床預(yù)后 激素聯(lián)合丙球治療組(聯(lián)合組)和單純應(yīng)用激素治療組(對照組)患者的性別、年齡及治療前的EDSS評分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。聯(lián)合組治療后EDSS評分與治療前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合組治療前后EDSS的變化量與對照組治療前后EDSS的變化量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

表1 治療前后兩組EDSS評分比較

2.2 T細(xì)胞的功能 治療前兩組患者的刺激指數(shù)(Stimulation index，SI)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后聯(lián)合組的SI顯著低于對照組(P＜0.05)，聯(lián)合組治療前后SI差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖1)。

圖1 治療前后兩組的刺激指數(shù)(SI)注:治療前后比較，P＜0.05

2.3 細(xì)胞因子IFN-γ和IL-10的檢測結(jié)果 治療前，聯(lián)合組與對照組相比，任何細(xì)胞因子的基礎(chǔ)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。兩組治療后，IFN-γ的水平均顯著降低(P＜0.05)，治療后聯(lián)合組與對照組相比，IFN-γ的水平亦顯著降低(P＜0.05)。治療后聯(lián)合組IL-10的水平較治療前顯著增加(P＜0.05)，其IL-10的水平明顯高于對照組(P＜0.05)，對照組在治療前后的IL-10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

表2 治療前后兩組IFN-γ和IL-10濃度比較(ρg/mL，±s)

表2 治療前后兩組IFN-γ和IL-10濃度比較(ρg/mL，±s)

注:與同組治療前比較，*P＜0.05，#P＞0.05;與對照組比較，▲P＜0.05

聯(lián)合組(n=20)治療前 治療后對照組(n=21)治療前 治療后IFN-γ 2 157±248 987±134＊▲ 2 198±150 1 564±130*IL-10 3 845±3304 736±450＊▲ 3 516±314 4 080±423#

2.4 細(xì)胞因子IL-6的檢測結(jié)果 聯(lián)合組治療后與同組治療前、對照組治療后IL-6的水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表3)。

表3 兩組治療前后血清IL-6變化(±s)

表3 兩組治療前后血清IL-6變化(±s)

注:與同組治療前比較，*P＜0.05;與對照組比較，#P＜0.05

聯(lián)合組(n=20)治療前 治療后對照組(n=21)治療前 治療后IL-6(g/L) 235.43±40.35 16.62±6.51* 236.36±41.42 23.46±9.63*

3 討論

多發(fā)性硬化是一種主要由細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的自身免疫性疾病，免疫功能喪失或免疫平衡失調(diào)是其主要病理機(jī)制。有證據(jù)表明，髓鞘特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化是多發(fā)性硬化的重要發(fā)病機(jī)制。活化T細(xì)胞分泌Th1/Th2兩種類型的細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，在多發(fā)性硬化急性期，Th1型細(xì)胞因子明顯增加，而Th2型細(xì)胞因子分泌量很少，緩解期正好相反［7］，提示 Th1/Th2平衡對于多發(fā)性硬化病情的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸極其重要。目前較多研究認(rèn)為，Th1細(xì)胞因子能加重多發(fā)性硬化病情，而Th2細(xì)胞因子則有助于病情緩解及康復(fù)［8］。其中 Th1類細(xì)胞因子主要包括 IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12 等，而 Th2 細(xì)胞因子包括 IL-4、IL-10等。因此，降低Th1類細(xì)胞因子、升高Th2類細(xì)胞因子的干預(yù)方法，可能會改善多發(fā)性硬化患者的癥狀。

短期內(nèi)高血藥濃度的甲潑尼龍對人體神經(jīng)系統(tǒng)有強(qiáng)烈的非特異性免疫抑制作用［9］，可快速減輕急性脫髓鞘病變組織的炎癥和水腫，較快逆轉(zhuǎn)神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯［10］，改善脫髓鞘區(qū)神經(jīng)傳導(dǎo)功能［11］。從而降低多發(fā)性硬化患者 EDSS評分，改善患者癥狀。

丙種球蛋白具有免疫調(diào)節(jié)功能。本文結(jié)果顯示，激素聯(lián)合丙種球蛋白治療組可顯著降低IFN-γ、IL-6的水平，升高IL-10的水平;單純應(yīng)用激素治療組亦可明顯降低IFN-γ的水平，但治療后激素聯(lián)合丙種球蛋白治療組與單純應(yīng)用激素治療組比較，IFN-γ水平的降低更加顯著。亦有報(bào)道顯示，丙種球蛋白可抑制致病性細(xì)胞因子，Ig Fab能特異性結(jié)合 IL-1a、IL-2、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ，阻止細(xì)胞因子與相應(yīng)受體結(jié)合，抑制細(xì)胞因子的生物學(xué)活性［12］，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫、治療自身免疫性疾病的作用。丙種球蛋白具有抑制體外T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，這些細(xì)胞因子包括IL-2、TNF-β、IFN-γ［13］和 IL-6［14］;升高 IL-10 的水平［15］。

總之，激素和丙種球蛋白對多發(fā)性硬化的治療均有療效，兩者聯(lián)合治療多發(fā)性硬化的療效優(yōu)于單純應(yīng)用激素組，起到雙重的免疫調(diào)節(jié)作用。激素治療多發(fā)性硬化可通過非特異性免疫抑制作用而實(shí)現(xiàn)，丙種球蛋白可增加抗炎細(xì)胞因子的水平，降低炎性細(xì)胞因子的水平，而實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)的作用，降低多發(fā)性硬化患者的EDSS評分，改善患者癥狀。靜脈注射丙種球蛋白后所導(dǎo)致的IFN-γ、IL-6降低和IL-10濃度的增加，提示靜脈注射丙種球蛋白可通過調(diào)節(jié)抗炎細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞因子的水平對多發(fā)性硬化的異常免疫應(yīng)答起調(diào)節(jié)作用，有效改善患者癥狀。

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