槐杞黃對哮喘大鼠BALF中IL-5及INF-γ的影響

張琴珍，尚云曉

支氣管哮喘是以氣道高反應(yīng)性和嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥為特征的免疫紊亂性疾病。眾多研究表明，Th1/Th2功能失衡、Th2細(xì)胞優(yōu)勢分化是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的重要機制之一［1］。IL-5是由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它促進嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和在氣道的聚集。Th1細(xì)胞分泌INF-γ等細(xì)胞因子，抑制哮喘反應(yīng)。目前，支氣管哮喘的治療主要依靠抗炎和解痙，而針對免疫發(fā)病機制的治療較為薄弱。槐杞黃為臨床輔助治療兒童支氣管哮喘的免疫調(diào)節(jié)藥物，本實驗通過給予哮喘動物模型不同的干預(yù)措施，測定Th1、Th2細(xì)胞因子水平，比較不同干預(yù)效果，以期為兒童哮喘的臨床治療提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 卵蛋白(美國Sigma公司)，百日咳滅活菌苗(北京生物制品研究所)，醋酸地塞米松片(天津藥業(yè)有限公司)，槐杞黃(啟東蓋天力藥業(yè)有限公司)，ELISA試劑盒(美國GBD公司)。

1.2 實驗動物 雌性Wistar大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量(140±10)g，由中國醫(yī)科大學(xué)中心實驗室動物部提供，飼養(yǎng)條件一致。

1.3 分組和模型制備

1.3.1 動物分組 隨機分成4組:正常對照組(N)、哮喘模型組(A)、地塞米松組(DXM)、地塞米松組+槐杞黃組(H)，每組10只。按不同的影響因素分別進行研究。飼養(yǎng)期間給予正常飲食。

1.3.2 大鼠哮喘模型的制作［2］除N組外，于第1、7天，各組大鼠腹腔注射1%卵蛋白1 mg、1%氫氧化鋁凝膠及6×109/mL百日咳滅活菌苗致敏液共1 mL，共致敏2次。第15天開始霧化吸入2%卵蛋白誘喘。每日30 min，連續(xù)7 d。N組大鼠以生理鹽水代替激發(fā)液進行處理。

1.3.3 給藥 自第15天起連續(xù)7 d，激發(fā)前30 min，各組灌胃給藥(均配成3 mL)。N組:生理鹽水3 mL;A組:生理鹽水3 mL;D組:地塞米松1 mg/kg，3 mL;H組:地塞米松1 mg/kg+槐杞黃8 g/kg，3 mL。

1.4 取材 于末次激發(fā)后24 h內(nèi)取材。以10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后，固定于解剖板，75%酒精消毒，打開胸腔和頸部。心尖取血，靜置2 h，3 000 r/min 4℃離心10 min，取上清 －80℃保存待測細(xì)胞因子。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)計數(shù):①止血鉗夾閉氣管上端和右肺主支氣管;②灌洗支氣管和左側(cè)肺:用密閉式靜脈留置針插入氣管上端，0.5 mL PBS反復(fù)沖洗，共4次，共回收到1.7 mL以上灌洗液，回收率超過85%;③灌洗液4℃、1 500 r/min離心10 min;④回收上清，－80℃保存待檢細(xì)胞因子;⑤用1 mL含有1%BSA的PBS重懸細(xì)胞沉淀，取10 μL重懸液進行細(xì)胞計數(shù)。余液再次4℃離心，參數(shù)同上;⑥離心后去上清，滴入1滴血清，輕吹散細(xì)胞，涂片3張;⑦涂片瑞氏-吉姆薩染色，細(xì)胞分類計數(shù)，于光學(xué)顯微鏡下進行細(xì)胞分類，至少數(shù)300個細(xì)胞每視野，至少進行4個視野的細(xì)胞計數(shù)。算出嗜酸細(xì)胞的百分比，用細(xì)胞總數(shù)乘以百分比，即得出嗜酸細(xì)胞的絕對值。

1.5 ELISA檢測各組大鼠血清OVA特異性IgE、BALF中 IL-5、INF-γ 嚴(yán)格按照試劑盒(美國GBD公司)要求操作，試劑盒的檢測最低限為1 ng/mL。IL-5、INF-γ操作步驟按試劑盒要求進行。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到直線方程后，根據(jù)各樣品孔OD值推算出樣品中IL-5、INF-γ含量(pg/mL)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，ANOVE Tukey檢驗比較各組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 經(jīng)OVA激發(fā)后，模型組小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸增快、咳嗽、腹肌收縮、弓背向上、抓撓口鼻、反應(yīng)遲鈍、二便失禁等癥狀，嚴(yán)重者可見呼吸急促，呼吸節(jié)律不整，口唇紫紺;長期激發(fā)可見體質(zhì)量減輕，毛色失去光澤，精神狀態(tài)差。給藥組和陽性對照組上述癥狀可獲得不同程度的緩解。

2.2 對血清各項指標(biāo)的影響 對血清中OVAIgE、BALF中IL-5含量和細(xì)胞總數(shù)(×106/mL)及Eos%的影響:上述各指標(biāo)A組較N組顯著增高(P＜0.05);D組和H組較哮喘模型組有所改善(P＜0.05);H組較D組進一步下降(P＜0.05);與N組相比，H組OVA-IgE、IL-5含量和Eos%基本降至正常水平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。BALF中 INF-γ的水平:A組低于 N組(P＜0.05);D組和H組各指標(biāo)較A組回升(P＜0.05);H組較D組進一步回升(P＜0.05)，與N組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同干預(yù)對血清各項指標(biāo)的影響(±s)

表1 不同干預(yù)對血清各項指標(biāo)的影響(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.05;與哮喘組比較，#P＜0.05

組別 只 OVA-IgE IL-5 INF-γ 細(xì)胞總數(shù) Eos(%)P N 10 172.29±2.98 22.87±6.26 80.19±8.82 1.17±0.34 0.89±0.49 ＜0.05#10 436.40±2.77 54.94±10.32 55.83±10.08 2.91±0.62 20.85±17.49 ＜0.05*D 10 268.56±4.83 43.63±7.96 63.10±5.75 2.07±0.63 11.55±7.73 ＜0.05*#H 10 179.22±3.98 27.61±5.24 74.43±7.60 1.52±0.53 2.52±4.40 ＜0.05#*A

3 討論

大量研究表明，支氣管哮喘的發(fā)病過程中存在Th2細(xì)胞的過度分化和Th2細(xì)胞因子的過度分泌，是氣道炎癥啟動和維持的關(guān)鍵因素。在哮喘的發(fā)病機制中，細(xì)胞因子不僅在慢性氣道炎癥中起著重要作用，在很大程度上還決定著Th細(xì)胞的分化趨勢。有研究表明，Th類型的主要依據(jù)為Th0在受到外界抗原刺激后，主要分泌哪類細(xì)胞因子，而調(diào)控和決定細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵取決于哪類轉(zhuǎn)錄因子占主導(dǎo)，STAT4/STAT6、T-bet/GATA-3兩組轉(zhuǎn)錄因子在Th0分化中起關(guān)鍵作用［3］。IL-5的異常分泌與轉(zhuǎn)錄因子 Sp1、E12/E47、Oct-2、c/EBPbeta、GATA-3和酪氨酸激酶JAK2、JAK1等表達異常有關(guān)［4-5］。Th2細(xì)胞主要分泌包括 IL-5在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子。IL-5是Eos的存活發(fā)育因子，可刺激骨髓Eos增生，并促使Eos從骨髓到外周血再向氣道募集，是較強的Eos增殖和趨化因子。IL-5還可促使Eos活化，并誘導(dǎo)Eos釋放陽離子蛋白等毒性蛋白顆粒，產(chǎn)生過氧化物陰離子等增多。另外，IL-5還可以通過抑制Eos凋亡而增強其存活力，從而導(dǎo)致哮喘的嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥［6］。Th1細(xì)胞主要分泌包括INF-γ在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子。INF-γ在支氣管哮喘中起保護作用，其分泌減少與哮喘的發(fā)生關(guān)系密切［7］。眾多研究表明，糾正Th1/Th2功能失衡，可以減輕支氣管哮喘的癥狀［8］。槐杞黃由中藥槐耳、枸杞和黃精等成分組成。體外研究表明，中藥槐耳可通過多種途徑對T淋巴細(xì)胞紊亂進行調(diào)節(jié)［9］。筆者通過比較干預(yù)前后各種細(xì)胞因子水平，證實哮喘大鼠模型存在嗜酸性粒細(xì)胞大量聚集的氣道炎癥、Th2優(yōu)勢分化和Th2細(xì)胞因子過度分泌的Th1/Th2功能失衡。通過地塞米松的治療，上述情況可以得到一定程度的緩解，而加用槐杞黃則可使上述情況基本恢復(fù)至正常水平。本實驗僅初步驗證了槐杞黃可調(diào)節(jié)Th1/Th2功能失衡，其具體機制尚待進一步的研究。

［1］ Wegmann M.Th2 cells as targets for therapeutic intervention in allergic bronchial asthma［J］.Expert Rev Mol Diagn，2009，9(1):85-91.

［2］ Leung SY，Eynott P，Nath P.Effect of ciclesonide and fluticasone propionate on allergen-induced airway inflammation and remodeling features［J］.J Allergy clin Immunol，2005，115(5):989-996.

［3］ Ahlfors H，Limaye A，Elo LL.SATB1 dictates expression of multiple genes including IL-5 involved in human T helper cell differentiation［J］.Blood，2010，116(9):1443-1453.

［4］ Takatsu K，Kouro T，Nagai Y.Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response［J］.Adv Immunol，2009，101:191-236.

［5］ Nakamura Y，Ghaffar O，Olivenstein R，et al.Gene expression of the GATA-3 transcription factor is increased in atopic asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，1999，103(2 Pt 1):215-222.

［6］ Kim SH，Lee YC.Piperine inhibits eosinophil infiltration and airway hyperresponsiveness by suppressing T cell activity and Th2 cytokine production in the ovalbumin-induced asthma model［J］.J Pharm Pharmacol，2009，61(3):353-359.

［7］ Kandelaki ET，Nemsadze KP，Chkhaidze IG.INF-gamma during respiratory-syncytial induced obstructive respiratory syndrome in infection in children under one year of age［J］.Georgian Med News，2005(129):69-73.

［8］ Yuan L，Wu L，Chen J.Paclitaxel acts as an adjuvant to promote both Th1 and Th2 immune responses induced by ovalbumin in mice［J］.Vaccin，2010，28(27):4402-4410.

［9］ 俞建.槐耳對哮喘緩解期兒童T淋巴細(xì)胞調(diào)控失衡的影響［N］.第八屆亞太兒科變態(tài)反應(yīng)、呼吸和免疫學(xué)會(APAPARI)年會.2009.