鹽酸洛美沙星大鼠在體腸吸收動力學研究

鄭雪靜，趙慶春 ，顏 鳴，鄭永昌，程 剛

鹽酸洛美沙星為第三代喹喏酮類廣譜抗菌藥物，該藥抗菌活性強，對革蘭陽性菌的抗菌活性與諾氟沙星相同，強于依諾沙星;對革蘭陰性菌的作用與依諾沙星相同，毒性低，廣泛用于治療敏感細菌引起的呼吸道、泌尿生殖系統、胃腸道、皮膚軟組織等感染。由于大鼠腸道吸收特點與人體吸收的相關性已經由許多實驗得到證實，為探討鹽酸洛美沙星在不同腸段的吸收特征，指導口服類劑型的設計，本文采用大鼠在體腸吸收試驗方法［1］，對鹽酸洛美沙星的吸收部位和吸收動力學進行研究，希望對劑型設計提供可靠的生物藥劑學依據。

1 實驗材料

Waters501高效液相色譜儀(美國Waters公司);UV-2501PC紫外分光光度計(島津);Sartorius普及型pH計(pB-10)，德國賽多利斯股份有限公司);離心機:TBL-16B高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);AUW120D島津分析天平;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);恒流泵:EYELA CERAMIC PUMP VSP-3050(VSP-3050型中壓柱層析，日本東京理化株式會社)。鹽酸洛美沙星(南通林港有限公司);酚紅(天津市博迪化工有限公司);烏拉坦(中國醫藥集團上海化學試劑公司);Kreb-Ringer's營養液［2］(簡稱 K氏液，自配，每1 000 mL內含有 NaCl 7.80 g;KCl 0.35 g;NaHCO31.37 g;NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，葡萄糖 1.40 g);其他試劑均為分析純。雄性Wister大鼠，體質量(250±20)g(沈陽藥科大學實驗動物中心，合格證號:遼實動質字2003-008)。

2 方法

2.1 腸循環液中酚紅的濃度測定

2.1.1 酚紅標準曲線的建立 精密吸取Kreb-Ringer's營養液，配制含酚紅濃度為10、20、30、40、50 μg/mL系列標準液，分別吸取0.5 mL加入0.2 mol/L NaOH溶液5 mL顯色，在波長558 nm處，以0.2 mol/L NaOH為空白對照，測定吸收度A值。以吸收度A對酚紅濃度C做線性回歸，得標準曲線方程:A=0.017 6 C+0.014 8，R2=0.999 6。

2.1.2 腸循環液中酚紅濃度的測定 取大鼠在體腸循環液在不同時間點的樣品，分別吸取0.5 mL，加入0.2 mol/L NaOH溶液5 mL顯色，以0.2 mol/L NaOH為空白，在558 nm處測定吸光度A，代入標準曲線方程求得酚紅濃度。

2.2 腸循環液中鹽酸洛美沙星濃度的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:DiamonsilTMC18(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:0.02 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調節pH至2.6)∶乙腈(體積比 85∶15)檢測波長:287 nm;進樣量:20 μL;流速:1 mL/min;柱溫:室溫。分別取空白腸循環液(即加入酚紅K氏液進行大鼠小腸循環灌注2 h)、鹽酸洛美沙星對照液及樣品溶液(腸循環液)，按“2.2.1”色譜條件下測定。結果表明，鹽酸洛美沙星保留時間約為12 min，樣品液的主峰保留時間與對照液一致，空白腸循環液對測定無干擾。

2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取鹽酸洛美沙星貯備液適量，用含有酚紅20 μg/mL的K氏液稀釋含鹽酸洛美沙星濃度為 20、30、50、100、150、200 μg/mL系列的鹽酸洛美沙星溶液，在上述色譜條件下，以峰面積A對濃度C進行線性回歸，得標準曲線方程:A=2.298 7×104C－105 23，r=0.999 6(n=6)。

2.2.3 腸循環液中鹽酸洛美沙星的濃度測定在不同時間點取大鼠在體腸循環液樣品續濾液20 μL，注入高效液相色譜儀，代入“2.2.2”項下標準曲線，計算鹽酸洛美沙星的濃度。

2.3 大鼠在體腸循環液實驗

2.3.1 供試液的配制 精密稱取酚紅20 mg于1 000 mL量瓶中，用K氏液溶解并定容，得空白腸循環液。稱取鹽酸洛美沙星約100 mg于1 000 mL上述腸循環液中，充分攪拌使藥物溶解，過0.45 μm的微孔濾膜，避光冷藏作為貯備液。將貯備液以空白腸循環液稀釋一定倍數，吸取20 μL進行液相色譜分析，測定藥物峰面積，代入“2.2.2”項下標準曲線方程，計算貯備液中藥物濃度。在腸吸收實驗之前，根據測定結果量取適量貯備液，以空白腸循環液配制成不同濃度以及不同pH值的鹽酸洛美沙星供試液。

2.3.2 腸吸收試驗方法［3］選擇實驗前禁食12 h(不禁水)的大鼠，腹腔注射20%烏拉坦溶液(1.0 g/kg)麻醉后固定。沿腹中線切開腹腔，在實驗腸段兩端各切一小口，在上下兩端小口處各插入玻璃管，并用手術線固定。用37℃生理鹽水緩緩注入腸管，洗凈腸段內容物。用硅膠管將腸段兩端的玻璃管與蠕動泵及供試液連接，形成回路，開動蠕動泵。取預熱的37℃供試液200 mL，先以5 mL/min流速循環10 min后，將流速調節為2.5 mL/min進行回流，于回流 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 取回流液2 mL，同時補充等量的空白腸循環液。樣品經0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續濾液0.5 mL，用紫外分光光度法測定酚紅濃度，取20 μL用于高效液相分析，測定鹽酸洛美沙星的濃度。分別考察各腸段區間如下:十二指腸段自幽門1 cm處開始;空腸距幽門15 cm處開始;回腸段自盲腸上行20 cm處開始;結腸段從盲腸后段開始;腸段區間均取10 cm。整腸段自十二指腸上端起到回腸下端止。

2.3.3 鹽酸洛美沙星在腸循環液中穩定性考察

取20 mL鹽酸洛美沙星供試液于循環裝置中，在同樣實驗條件下循環，分別在0、1、2、3、4 h取樣，按照“2.2.2”項下操作測定鹽酸洛美沙星的在腸循環液中含量變化。

3 結果

3.1 腸循環液中藥物濃度的方法學結果 酚紅測定方法的回收率和精密度:酚紅低、中、高3個濃度(10、20、30 μg/mL)，平均回收率為 99.82%、99.39%、100.22%(n=5)，精密度 RSD分別為0.18%、0.33%、0.29%(n=5)。

鹽酸洛美沙星測定方法的回收率和精密度:鹽酸洛美沙星低、中、高 3個濃度(1.5、15、150 μg/mL)，平均回收率為 98.93%、99.20%、100.10%(n=5);精密度 RSD分別為0.28%、0.35%、0.13%(n=5);日內精密度 RSD為0.38%、0.45%、0.36%(n=5);日間精密度RSD為0.42%、035%、0.46%(n=5)。結果表明，測定方法回收率和精密度均符合要求，證明該方法適用于藥物含量測定。

3.2 鹽酸洛美沙星在腸循環液中穩定性 鹽酸洛美沙星在腸循環液中含量沒有明顯變化，穩定性良好(RSD=1.15%)。

3.3 在體腸吸收動力學研究結果及影響因素

3.3.1 數據處理方法［4］吸收百分率:通過測定吸收前后供試液中藥物濃度的變化，計算藥物總的減少值，以求得小腸對藥物的吸收量。由于小腸對藥物吸收的同時也吸收水分，因此，供試液中加入不被吸收的酚紅，根據酚紅的濃度可以矯正供試液體積的變化，以便準確求出藥物總量的變化。藥物吸收百分率按以下公式進行計算:

式中:C0:原供試液中藥物的濃度(μg/mL);V0:原供試液體積(mL);C0':原供試液中酚紅的濃度(μg/mL);C1':回流4 h后循環液中酚紅的濃度(μg/mL);C1:回流4 h后循環液中藥物的濃度(μg/mL)。

吸收百分數速率常數:以每一時刻循環液中剩余藥量均值的對數對時間做圖，得一條直線，說明藥物吸收為表觀一級速度過程。可按以下公式計算:

式中:lnX和lnX0分別表示循環液中剩余藥量和原供試液中藥量的對數值，Ka表示吸收速率常數，t表示時間。

3.3.2 各腸段吸收速率常數及吸收百分數 見表1。配制20 μg/mL供試液，分別在十二指腸、空腸、回腸和結腸回流4 h，并于規定時間取樣。以各取樣點剩余藥量取對數值對時間做圖，根據斜率求出各腸段吸收速率常數Ka，并求得回流4 h的吸收百分數。結果見表1。可知，十二指腸、空腸、回腸和結腸的吸收速率常數和吸收百分率差異有統計學意義，并按照空腸＞十二指腸＞回腸＞結腸的順序依次降低。

表1 鹽酸洛美沙星在大鼠各腸段的吸收速率常數及吸收百分數(±s，n=5)

表1 鹽酸洛美沙星在大鼠各腸段的吸收速率常數及吸收百分數(±s，n=5)

部位 吸收(%) Ka(h－1)十二指腸20.2 0.204 5±0.034 4空腸 23.3 0.321 0±0.045 8回腸 16.3 0.183 9±0.038 2結腸12.4 0.129 2±0.045 3

3.3.3 不同藥物濃度對腸吸收的影響 見表2。

表2 不同濃度鹽酸洛美沙星的腸吸收速率常數及吸收百分數(±s，n=5)

表2 不同濃度鹽酸洛美沙星的腸吸收速率常數及吸收百分數(±s，n=5)

濃度(μg/mL) 吸收(%) Ka(h－1)1.5 20.28±2.810 0.192 7±0.091 2 15.0 24.27±2.919 0.219 2±0.032 1 150.0 28.22±3.190 0.230 9±0.048 2

由表2可知，在1.5～150 μg/mL內藥物的吸收量和質量濃度線性關系良好，吸收速率常數幾乎保持不變，表明藥物吸收是被動擴散的結果。

3.3.4 不同pH值對腸吸收的影響 見表3。由表3可知，對不同pH值條件下吸收速率常數進行方差分析，結果表明，溶液的pH值對小腸吸收基本無影響。

表3 不同pH值下鹽酸洛美沙星的腸吸收速率常數及吸收百分數(±s，n=5)

表3 不同pH值下鹽酸洛美沙星的腸吸收速率常數及吸收百分數(±s，n=5)

pH值 吸收(%) Ka(h－1)6.29 20.23±2.181 0.163 1±0.029 2 6.79 22.21±2.902 0.181 9±0.023 1 7.40 18.29±1.931 0.160 2±0.031 1

4 討論

4.1 藥物濃度測定方法的選擇 采用在體腸吸收實驗來研究鹽酸洛美沙星在大鼠腸道內的吸收動力學特征，方法簡便、快捷，不損傷大鼠的血管及神經，可以有效模擬藥物在腸道不同部位的吸收情況。由于酚紅不被腸壁所吸收，可以用來測定小腸對水分的吸收，進而計算腸循環液中藥物濃度的變化。本實驗中藥物濃度的測定采用高效液相色譜法，與常規的雙波長法比較，測定結果準確、可靠。

4.2 藥物的吸收機制 本實驗結果表明，藥物濃度及pH值對藥物吸收幾乎無影響，小腸吸收速率常數間差異無統計學意義，所以鹽酸洛美沙星的大鼠腸吸收屬于一級動力學過程［5］，吸收機制為被動擴散。但是各腸段之間的吸收差異有統計學意義，藥物在全小腸段的吸收良好，而在結腸段的吸收較差，從而為鹽酸洛美沙星的劑型設計奠定基礎。

4.3 實驗結果對劑型設計的指導意義 胃腸道吸收機制的研究是處方前的重要工作，能夠指導人們根據藥物的吸收機制和吸收部位特點選擇合適的劑型，保證和提高藥物制劑的生物利用度，從而減少劑型設計的盲目性。本實驗中鹽酸洛美沙星在大鼠全腸段均有吸收，吸收符合一級動力學特征，吸收機制為被動轉運。

［1］ 梁桂賢.藥物腸吸收研究方法近況［J］.山西職工醫學院學報，1997，7(2):57-59.

［2］ 毛鳳斐，屠錫德，朱家璧，等.黃芩甙大鼠小腸吸收的研究［J］.南京藥學院學報，1984，15(1):61-63.

［3］ 平其能.藥劑學實驗與指導方針［M］.北京:中國醫藥科技出版社，1994:214-218.

［4］ 陶秀梅，唐星.利巴韋林大鼠腸吸收動力學［J］.沈陽藥科大學學報，2004，21(6):401-404.

［5］ 宋洪濤，謝彤，唐魯平，等.川芎嗪大鼠在體腸吸收動力學［J］.中國醫院藥學雜志，2005，25(10):905-907.