西羅莫司血藥濃度測定方法的建立及在肝移植患者中的應用

張 寧，呂慧怡*，鄧 卅，范 青

西羅莫司(Sirolimus，SRL，商品名 Rapamune，雷帕霉素)，是一種大環內酯類免疫抑制劑，具有抗增殖、抗腫瘤及無腎毒性等特性，近年來逐漸應用于肝移植患者，使臨床獲得了防治肝移植術后腎功能不全、慢性排斥反應、腫瘤復發和提高移植物長期存活的新途徑［1］。血藥濃度監測對于保證SRL免疫抑制效果和臨床安全性具有重要的意義。本文采用高效液相色譜法測定西羅莫司血藥濃度，并分析此方法在肝移植患者中的合理應用。

1 實驗材料

1.1 儀器 日本島津HPLC色譜儀(LC-20AT二元梯度泵，COM-20A控制模塊，SPD-M20A二極管陣列檢測器)，QT-330型色譜柱恒溫箱(大連三杰科技發展有限公司)，wi2568529電動離心機(東儀科技有限公司)，AS701KDT型超聲波清洗器(北京鴻泰順達科技有限公司)，XY-22型濃縮氮吹儀(青島新益通有限公司)，YKH-Ⅱ 型液體快速混旋器(江西醫療器械廠)，AW-120型分析天平(日本島津)。

1.2 藥品與試劑 西羅莫司對照品(純度為98.0%，天津新美科技有限公司)，32-去甲基雷帕霉素(純度為98.0%，天津新美科技有限公司)，甲醇(色譜純，天津康巢正興科技發展有限公司)，氫氧化鈉(分析純，上海慈太龍實業有限公司)，乙腈(色譜純，天津市康巢科技開發有限公司)，硫酸鋅(分析純，上海光鏵科技有限公司)，1-氯正丁烷(≥99.5，廣州偉伯化工有限公司)。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，大連伊利特分析儀器有限公司);流動相:乙腈-甲醇-水(7.5∶62.5∶30);流速:1.2 mL/min;紫外檢測波長:276 nm;進樣量:20 μL;柱溫:50℃;內標物:32-去甲基雷帕霉素。在上述色譜條件下，全血中內源性雜質不影響西羅莫司與內標的分離測定，西羅莫司與內標的保留時間分別為16.3、26.8 min，空白全血、對照品及全血樣品色譜圖，如圖1。

2.2 標準溶液配制

2.2.1 西羅莫司對照品溶液配制 精密稱取西羅莫司標準品1 mg，置于10 mL的容量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得濃度為100 μg/mL的西羅莫 司標準溶液，備用。

圖1 西羅莫司的高效液相色譜圖注:A.空白全血;B.對照品;C.全血樣品;Ⅰ-SRL，Ⅱ-內標

2.2.2 內標溶液配制 精密稱取32-去甲基雷帕霉素0.5 mg，置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，制成濃度為50 μg/mL的內標液。精密量取內標液1 mL，置于100 mL的容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制得500 ng/mL的內標標準溶液，備用。

2.3 樣品的處理 精密量取全血1.0 mL，置10 mL具塞離心試管中，加入500 ng/mL的內標溶液20 μL，旋渦混合 30 s后，加入蛋白沉淀劑(甲醇∶25%ZnSO4=70∶30)2.0 mL，旋渦混合30 s，4 500 r/min離心 10 min，取上清液加入0.1 mol/L NaOH 溶液 400 μL，混勻 15 s，加入1.0 mL 1-氯正丁烷，水平振蕩10 min，4 500 r/min離心10 min。分離有機層，下層水相加入1.0 mL的1-氯正丁烷重復提取1次，合并有機層以N2流吹干。殘渣加入甲醇50 μL旋渦混合30 s。取20 μL進樣，記錄色譜圖，以SRL峰面積(Ai)與內標峰面積(As)之比Y代入標準曲線，計算SRL全血濃度。

2.4 標準曲線 分別精密吸取不同體積的西羅莫司標準溶液，置于10 mL具塞離心管中，加入精密量取的空白全血1.0 mL，混勻，使其濃度分別為2.0、4.0、8.0、15.0、30.0、50.0 ng/mL。按“2.3”操作，以不同濃度西羅莫司系列溶液的Ai/As來計算Y(Y=Ai/As)，以Y值為縱坐標、西羅莫司濃度C為橫坐標進行線性回歸。在2.0～50.0 ng/mL濃度范圍內，血藥濃度與峰面積比有良好線性關系，其回歸方程為:Y=0.119 5 C+0.054 8(r=0.999 7)。

2.5 回收率及精密度 分別在1.0 mL空白全血中加入低、中、高3種濃度的西羅莫司溶液40 μL，混勻，使其濃度分別為 4.0、15.0、50.0 ng/mL，按“2.3”方法操作，將SRL峰面積與內標峰面積之比Y代入標準曲線，計算SRL全血濃度，以測得值與加入值之比計算相對回收率，分別為101.0%、94.3%和101.9%(n=5)。另以1.0 mL空白全血不加藥品，按“2.3”操作，待萃取完畢后，在有機層中加入50%甲醇配制成的相應濃度的SRL溶液1.0 mL及內標標準溶液20 μL，繼續按“2.3”操作，以此為標準，將測定相對回收率所得濃度值與此方法所測得濃度值相比，計算SRL絕對回收率分別為85.4%、81.9%和79.4%(n=5)。按照測定相對回收率方法計算SRL全血濃度，以1 d內5次測得的SRL濃度計算日內精密度，分別為3.3%、1.1%、3.1%，以1周內5次測定的SRL濃度計算日間精密度，分別為6.3%、1.4%、5.4%。日內、日間RSD均小于10%，表明該方法精密度良好。

3 臨床應用

肝移植術后患者5例，男3例，女2例，平均年齡(40.2±11.5)歲。移植術后初期均采用以他克莫司為主的抗排斥治療方案，其中2例患者術后1個月內腎功能減退，懷疑因藥物副作用引起［2］，另外3例于術后6個月出現不能耐受的藥物不良反應，如高血糖、肌肉酸痛等，換以西羅莫司為主的抗排斥治療方案［3］。在服用西羅莫司片達到穩態后，在一次給藥間隔口服西羅莫司2 mg后，于0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、24.0 h測定西羅莫司全血濃度(藥-時曲線如圖2)。應用DAS 2.0版，藥物代謝動力學分析結果顯示，西羅莫司 Cmax為(12.66±4.1)ng/mL，t1/2為(19.2±11.2)h，tmax為(1.8±0.3)h。在5例肝移植患者使用過程中，出現總膽固醇升高2例，服用瑞舒伐他汀片(10 mg，1次/d口服)1個月后總膽固醇均降至正常范圍內，其他均未出現異常。

4 討論

由于測定西羅莫司血藥濃度時需用全血，而全血中的血細胞及蛋白質分子，會使萃取時發生乳化現象，對色譜柱分離產生較大的影響，因此，當西羅莫司從血細胞及血漿蛋白中提取至溶劑時，需加入蛋白沉淀試劑，沉淀、離心，從而消除細胞及蛋白干擾。而液-液萃取法是被測組分從生物基質中分離、純化的常用方法，它可將被測組分自大量內源性物質中選擇性地萃取分離。本實驗以1-氯正丁烷為萃取液，有選擇地將西羅莫司從混合液中萃取出來，然后將上層有機層(1-氯正丁烷)分離，再將萃取液揮發，最后得到濃集的被測組分。此方法簡便，色譜分離效果較好，主峰易于識別，缺點在于提取物質雜質較多、回收率低，影響了其在HPLC中的應用。

圖2 口服西羅莫司2 mg后藥-時曲線

國內的研究表明，SRL治療窗在穩態谷濃度4～8 ng/mL范圍內［4-5］，而不是國外推薦應用的10～15 ng/mL。在這個范圍內，既能有效預防移植肝發生急性排斥反應，又能減少其毒副作用。HPLC法測定西羅莫司的線性范圍為2.0～50 ng/mL，覆蓋SRL有效濃度范圍，但臨床監測中發現個別血藥濃度＜2.0 ng/mL，超出本實驗的線性范圍，給臨床調整給藥劑量造成一些不便。

［1］ 李冠軍，董桂青，金仲品.西羅莫司的研究進展［J］.中國醫療前沿，2008，3(2):34-36.

［2］ 馬秋野，孫峰，武步強，等.肝移植術后他克莫司血藥濃度與尿α1微球蛋白及微量白蛋白的相關性研究［J］.中國普外基礎與臨床雜志，2006，13(3):334-335.

［3］ Watson CJ，Gimson AE，Alexander GJ，et al.A randomized controlled trial of late conversion from calcineurin inhibitor(CNI)-based to sirolimus-based immunosuppression in liver transplant recipients with impaired renal function［J］.Liver Transpl，2007，13:1694-1702.

［4］ 張曉軍，傅志仁.西羅莫司在肝移植中的臨床應用［J］.肝膽胰外科雜志，2010，22(1):83-85.